면역 결핍 마우스에서 인간 골격 근 이종이식 수행
Summary
복잡한 인간 질병은 전통적인 실험실 모형 시스템에서 모델링하는 것이 어려울 수 있습니다. 여기에서, 우리는 면역 결핍 마우스로 인간 골격 근 생검의 이식을 통해 인간 근육 질병을 모델링하는 외과 접근을 기술합니다.
Abstract
동물 연구에서 관찰 하는 치료 효과 종종 임상 시험에서 되풀이 실패. 이 문제는 다각적인 것이지만, 이 실패의 한 가지 이유는 부적절한 실험실 모델을 사용하기 때문입니다. 전통적인 실험실 유기체에서 복잡한 인간 질병을 모델링하는 것은 어렵지만,이 문제는 인간 이종이식의 연구를 통해 회피 될 수 있습니다. 우리가 여기에서 설명하는 외과 방법은 근육 질병을 모델링하고 전임상 치료 시험을 실행하기 위하여 이용될 수 있는 인간 골격 근 이종이식의 창조를 허용합니다. 기관 검토 위원회 (IRB) 승인 된 프로토콜에 따라, 골격 근육 표본은 환자로부터 획득 한 다음 NOD-Rag1nullIL2rγnull (NRG) 숙주 마우스로 이식됩니다. 이 마우스는 성숙한 림프톨을 만드는 그들의 무능력 때문에 이식 연구 결과를 위한 이상적인 호스트이고 이렇게 세포 중재되고 체액 적응성 면역 반응을 개발할 수 없습니다. 숙주 마우스는 이소플루란으로 마취되고, 마우스 경질전방 및 경전지성 경골 근육이 제거된다. 인간의 근육의 조각은 다음 빈 경골 구획에 배치하고 peroneus longus 근육의 근위 및 원위 힘줄에 봉합된다. 이종이식 근육은 마우스 숙주에 의해 자발적으로 혈관화되고 내심이 생겨전 임상 연구의 모델로 사용될 수 있는 튼튼하게 재생되는 인간의 근육을 생성합니다.
Introduction
임상 시험을 진행중인 모든 약물 개발 프로그램의 13.8 %만이 성공하고 승인 된 치료법으로 이어진다고보고되었습니다1. 이 성공률은 이전에 보고된 10.4%보다 높지만2.여전히 개선의 여지가 있습니다. 임상 시험의 성공률을 높이기 위한 한 가지 접근법은 전임상 연구에 사용되는 실험실 모델을 개선하는 것입니다. 미국 식품의약국(FDA)은 1상 임상 시험 전에 치료 효능을 보여주고 독성을 평가하기 위한 동물 연구를 요구합니다. 그러나, 종종 동물 연구와 임상 시험 사이 치료 결과제한 된일치가 있다 3. 또한, 전임상 동물 연구의 필요성은 허용된 동물 모델이 없는 질병에서 치료 개발을 위한 극복할 수 없는 장벽이 될 수 있으며, 이는 종종 희귀 또는 산발성 질환의 경우이다.
인간 질병을 모델링하는 한 가지 방법은 인간 조직을 면역 결핍 마우스로 이식하여 이종이식을 생성하는 것입니다. 이종이식 모델에는 세 가지 주요 장점이 있습니다: 첫째, 다른 동물 모델에서는 결코 재현할 수 없는 인간 질병에 존재하는 복잡한 유전적 및 후생유전학적 이상을 재현할 수 있습니다. 둘째, 이종이식은 환자 샘플이 제공되는 경우 희귀하거나 산발적인 질병을 모델링하는 데 사용할 수 있습니다. 셋째, 이종이식은 완전한 생체 내 시스템 내에서 질병을 모델링합니다. 이러한 이유로, 우리는 이종이식 모델의 치료 효능 결과가 환자에서 시험으로 번역 될 가능성이 더 높다는 가설을 세워. 인간 종양 이종이식은 이미 다발성 골수종을 포함한 일반적인 암 에 대한 치료법을 개발하는 데 성공적으로 활용되었으며, 개별 환자를 위한 맞춤형치료법4,5,6, 7.
최근, 이종이식은 인간 근육 질환의 모델을 개발하는 데 사용되어왔다 8. 이 모형에서는, 인간 적인 근육 생검 견본은 이종이식을 형성하기 위하여 면역 결핍 NRG 마우스의 뒷다리로 이식됩니다. 이식된 인간 근섬유는 죽지만, 이종이식에 존재하는 인간 근육 줄기 세포는 이후에 이식된 인간 기저 라미나를 다시 채우는 새로운 인간 근섬유로 확장및 분화한다. 따라서, 이러한 이종이식에서 재생된 근섬유는 전적으로 인간이며 마우스 숙성에 의해 자발적으로 재혈관화되고 내심이 생겨납니다. 중요한 것은, 마우스로 이식된 근이영양증(FSHD) 환자 근육 조직은 인간 질환의 주요 특징, 즉 DUX4 전사 인자의발현8을재구성한다. FSHD는 DUX4의 과발현에 의해 발생, 이는 후성 유전학적으로 정상적인 근육 조직에서 침묵9,10. FSHD 이종이식 모델에서, DUX4 특이적 모르폴리노를 함유한 치료는 성공적으로 DUX4 발현 및 기능을 억압하는 것으로 나타났으며, FSHD 환자11에대한 잠재적치료 옵션이 될 수 있다. 이러한 결과는 인간의 근육 이종이식은 인간 근육 질환을 모델링하고 마우스에서 잠재적 인 치료를 테스트하는 새로운 접근 방식임을 보여줍니다. 여기서, 우리는 면역 결핍 마우스에서 인간 골격 근 이종이식을 만들기위한 수술 방법을 자세히 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
환자 유래 이종이식은 근육 질환을 모델링하고 전임상 연구를 수행하는 혁신적인 방법입니다. 골격 근 이종이식을 만들기 위해 여기에 설명된 방법은 빠르고 간단하며 재현 가능합니다. 일방적 인 수술은 15 ~ 25 분 또는 30 ~ 40 분 에서 양자 간 으로 수행 할 수 있습니다. 양측 이종이식은 추가적인 실험 적 유연성을 제공할 수 있습니다. 예를 들어, 연구원은 하나의 이종이식의 국부적 인 치료를 수?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 근염 협회와 피터 벅 재단에 의해 지원되었다. 우리는 이종이식 외과 기술에 있는 그녀의 전문지식을 공유하고 훈련을 공유해 준 Yuanfan 장 박사에게 감사드립니다.
Materials
| 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
| 20 x 30 mm micro cover glass | VWR | 48393-151 | |
| Animal Weighing Scale | Kent Scientific | SCL- 1015 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning, Cellgro | 30-004-CI | |
| AutoClip System | F.S.T | 12020-00 | |
| Castroviejo Needle Holder | F.S.T | 12565-14 | |
| Chick embryo extract | Accurate | CE650TL | |
| CM1860 UV cryostat | Leica Biosystems | CM1860UV | |
| Coplin staining jar | Thermo Scientific | 19-4 | |
| Dissection Pins | Fisher Scientific | S13976 | |
| Dry Ice – pellet | Fisher Scientific | NC9584462 | |
| Embryonic Myosin antibody | DSHB | F1.652 | recommended concentration 1:10 |
| Ethanol | Fisher Scientific | 459836 | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| Fiber-Lite MI-150 | Dolan-Jenner | Mi-150 | |
| Forceps | F.S.T | 11295-20 | |
| Goat anti-mouse IgG1, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21121 | recommended concentration 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG2b, AlexaFluor 594 | Invitrogen | A-21145 | recommended concentration 1:500 |
| Gum tragacanth | Sigma | G1128 | |
| Hams F-10 Medium | Corning | 10-070-CV | |
| Histoacryl Blue Topical Skin Adhesive | Tissue seal | TS1050044FP | |
| Human specific lamin A/C antibody | Abcam | ab40567 | recommended concentration 1:50-1:100 |
| Human specific spectrin antibody | Leica Biosystems | NCLSPEC1 | recommended concentration 1:20-1:100 |
| Induction Chamber | VetEquip | 941444 | |
| Iris Forceps | F.S.T | 11066-07 | |
| Irradiated Global 2018 (Uniprim 4100 ppm) | Envigo | TD.06596 | Antibiotic rodent diet to protect again respiratory infections |
| Isoflurane | MWI Veterinary Supply | 502017 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | surgical wipes |
| Mapleson E Breathing Circuit | VetEquip | 921412 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 | |
| Mobile Anesthesia Machine | VetEquip | 901805 | |
| Mouse on Mouse Basic Kit | Vector Laboratories | BMK-2202 | mouse IgG blocking reagent |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| NAIR Hair remover lotion/oil | Fisher Scientific | NC0132811 | |
| NOD-Rag1null IL2rg null (NRG) mice | The Jackson Laboratory | 007799 | 2 to 3 months old |
| O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Oxygen | Airgas | OX USPEA | |
| PBS (phosphate buffered saline) buffer | Fisher Scientific | 4870500 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Dynarex | 1415 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | Fisher Scientific | P10144 (no DAPI); P36935 (with DAPI) | |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | |
| Rimadyl (carprofen) injectable | Patterson Veterinary | 10000319 | surgical analgesic, administered subcutaneously at a dose of 5mg/kg |
| Scalpel Blades – #11 | F.S.T | 10011-00 | |
| Scalpel Handle – #3 | F.S.T | 10003-12 | |
| Stereo Microscope | Accu-scope | 3075 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Suture, Synthetic, Non-Absorbable, 30 inches long, CV-11 needle | Covidien | VP-706-X | |
| 1ml Syringe (26 gauge, 3/8 inch needle) | BD Biosciences | 329412 | |
| Trimmer | Kent Scientific | CL9990-KIT | |
| Vannas Spring Scissors, 8.0 mm cutting edge | F.S.T | 15009-08 | |
| VaporGaurd Activated Charcoal Filter | VetEquip | 931401 | |
| Wound clips, 9 mm | F.S.T | 12022-09 |
References
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