Summary

Realizando xenoenxertos de músculo esquelético humano em camundongos imunodeficientes

Published: September 16, 2019
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Summary

Doenças humanas complexas podem ser desafiadoras para modelar em sistemas de modelos laboratoriais tradicionais. Aqui, nós descrevemos uma aproximação cirúrgica para modelar a doença do músculo humano com a transplantação de biópsias humanas do músculo esqueletal em ratos immunodeficientes.

Abstract

Os efeitos do tratamento observados em estudos em animais muitas vezes não conseguem ser recapitulados em ensaios clínicos. Embora esse problema seja multifacetado, uma razão para essa falha é o uso de modelos laboratoriais inadequados. É desafiador modelar doenças humanas complexas em organismos laboratoriais tradicionais, mas esta questão pode ser contornada através do estudo de xenoenxertos humanos. O método cirúrgico que descrevemos aqui permite a criação de xenoenxertos de músculo esquelético humano, que podem ser usados para modelar a doença muscular e realizar testes terapêuticos pré-clínicos. um Conselho de revisão institucional (IRB)-protocolo aprovado, espécimes de músculo esquelético são adquiridos de pacientes e, em seguida, transplantados em NOD-Rag1NULLIL2rγNULL (NRG) hospedeiro camundongos. Esses camundongos são hospedeiros ideais para estudos de transplante devido à sua incapacidade de fazer linfócitos maduros e, portanto, não conseguem desenvolver respostas imunes adaptáveis mediadas por células e humorais. Camundongos hospedeiros são anestesiados com isoflurano, e os músculos do rato tibial anterior e extensor dos dedos longos são removidos. Uma parte do músculo humano é colocada então no compartimento tibial vazio e suturada aos tendões proximal e longe do ponto de origem do músculo do longo do peroneus. O músculo xenografado é espontaneamente vascularizado e inervado pelo hospedeiro do camundongo, resultando em músculo humano regenerado de forma robusta que pode servir de modelo para estudos pré-clínicos.

Introduction

Tem sido relatado que apenas 13,8% de todos os programas de desenvolvimento de medicamentos submetidos a ensaios clínicos são bem-sucedidos e levam a terapias aprovadas1. Quando esta taxa de sucesso for mais elevada do que os 10,4% relatados previamente2, há ainda uma sala significativa para a melhoria. Uma abordagem para aumentar a taxa de sucesso dos ensaios clínicos é melhorar os modelos laboratoriais utilizados na investigação pré-clínica. A administração de alimentos e drogas (FDA) requer estudos em animais para demonstrar a eficácia do tratamento e avaliar a toxicidade antes dos ensaios clínicos de fase 1. No entanto, muitas vezes há concordância limitada nos desfechos de tratamento entre estudos em animais e ensaios clínicos3. Além disso, a necessidade de estudos pré-clínicos em animais pode ser uma barreira intransponível para o desenvolvimento terapêutico em doenças que não têm um modelo animal aceito, o que geralmente é o caso de doenças raras ou esporádicas.

Uma maneira de modelar a doença humana é transplantar o tecido humano em camundongos imunodeficientes para gerar xenoenxertos. Existem três principais vantagens para os modelos de Xenoenxerto: primeiro, eles podem recapitular as complexas anormalidades genéticas e epigenéticas que existem na doença humana que podem nunca ser reprodutíveis em outros modelos animais. Em segundo, os xenoenxertos podem ser usados para modelar doenças raras ou esporádicas se as amostras do paciente estiverem disponíveis. Terceiro, os xenoenxertos modelam a doença dentro de um sistema completo in vivo. Por estas razões, nós supor que os resultados da eficácia do tratamento em modelos do xenograft são mais prováveis traduzir aos testes nos pacientes. Os xenoenxertos de tumores humanos já foram utilizados com sucesso para desenvolver tratamentos para cânceres comuns, incluindo mielomamúltiplo, bemcomo terapias personalizadas para pacientes individuais4,5,6, o 7.

Recentemente, os xenoenxertos têm sido usados para desenvolver um modelo de doença muscular humana8. Neste modelo, os espécimes humanos da biópsia do músculo são transplantados nos hindmembros de ratos immunodeficientes de NRG para dar forma a xenoenxertos. Os myofibers humanos transplantados morrem, mas as pilhas de haste humanas do músculo atuais no xenograft expandem subseqüentemente e diferenciam-se em myofibers humanos novos que repovoam o lamina básico humano enxertado. Conseqüentemente, os myofibers regenerados nestes xenoenxertos são inteiramente humanos e são revascularizados espontâneamente e inervado pelo anfitrião do rato. Importante, o tecido muscular do paciente da distrofia muscular fascioscapulohumeral (FSHD) transplantado em ratos recapitula características chaves da doença humana, a saber expressão do fator8da transcrição DUX4 . A FSHD é causada pela superexpressão de DUX4, que é epigeneticamente silenciada no tecido muscular normal9,10. No modelo de FSHD xenograft, o tratamento com um morfolino DUX4-specific foi mostrado para reprisificar com sucesso DUX4 expressão e função, e pode ser uma opção terapêutica potencial para pacientes de FSHD11. Estes resultados demonstram que os xenoenxertos do músculo humano são uma aproximação nova para modelar a doença do músculo humano e para testar terapias potenciais nos ratos. Aqui, nós descrevemos em detalhe o método cirúrgico para criar xenoenxertos humanos do músculo esqueletal em ratos immunodeficientes.

Protocol

Todo o uso de espécimes de pesquisa de sujeitos humanos foi aprovado pelo Conselho de revisão institucional (IRB) da Johns Hopkins para proteger os direitos e o bem-estar dos participantes. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais da Universidade Johns Hopkins (IACUC), de acordo com o guia nacional de saúde (NIH) para o cuidado e uso de animais de laboratório. Macho NOD-Rag1NULLIL2rγNULL (NRG) ca…

Representative Results

Como demonstrado por Yuanfan Zhang et al., este protocolo cirúrgico é um método direto para produzir xenoenxertos de músculo esquelético humano8. Xenoenxertos regenerados tornam-se espontaneamente inervado e exibem contratilidade funcional. Além, o músculo xenografados dos pacientes de FSHD recapitula mudanças na expressão de gene observadas em pacientes de FSHD8. Em nossa experiência, aproximadamente 7 de 8 xenoenxertos executados dos …

Discussion

Os xenoenxertos derivados do paciente são uma forma inovadora de modelar a doença muscular e realizar estudos pré-clínicos. O método descrito aqui para criar xenoenxertos do músculo esqueletal é rápido, direto, e reprodutível. Cirurgias unilaterais podem ser realizadas em 15 a 25 minutos, ou bilateralmente em 30 a 40 minutos. Os xenoenxertos bilaterais podem fornecer flexibilidade experimental adicional. Por exemplo, os pesquisadores podem realizar o tratamento localizado de um Xenoenxerto, com a outra esquerda …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela Associação de myositis e pela Fundação de Peter Buck. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Yuanfan Zhang por compartilhar sua expertise e treinamento na técnica cirúrgica do xenograft.

Materials

100 mm x 15 mm Petri dish Fisher Scientific FB0875712
2-Methylbutane Fisher O3551-4
20 x 30 mm micro cover glass VWR 48393-151
Animal Weighing Scale Kent Scientific SCL- 1015
Antibiotic-Antimycotic Solution Corning, Cellgro 30-004-CI
AutoClip System F.S.T 12020-00
Castroviejo Needle Holder F.S.T 12565-14
Chick embryo extract Accurate CE650TL
CM1860 UV cryostat Leica Biosystems CM1860UV
Coplin staining jar Thermo Scientific 19-4
Dissection Pins Fisher Scientific S13976
Dry Ice – pellet Fisher Scientific NC9584462
Embryonic Myosin antibody DSHB F1.652 recommended concentration 1:10
Ethanol Fisher Scientific 459836
Fetal Bovine Serum GE Healthcare Life Sciences SH30071.01
Fiber-Lite MI-150 Dolan-Jenner Mi-150
Forceps F.S.T 11295-20
Goat anti-mouse IgG1, Alexa Fluor 488 Invitrogen A-21121 recommended concentration 1:500
Goat anti-mouse IgG2b, AlexaFluor 594 Invitrogen A-21145 recommended concentration 1:500
Gum tragacanth Sigma G1128
Hams F-10 Medium Corning 10-070-CV
Histoacryl Blue Topical Skin Adhesive Tissue seal TS1050044FP
Human specific lamin A/C antibody Abcam ab40567 recommended concentration 1:50-1:100
Human specific spectrin antibody Leica Biosystems NCLSPEC1 recommended concentration 1:20-1:100
Induction Chamber VetEquip 941444
Iris Forceps F.S.T 11066-07
Irradiated Global 2018 (Uniprim 4100 ppm) Envigo TD.06596 Antibiotic rodent diet to protect again respiratory infections
Isoflurane MWI Veterinary Supply 502017
Kimwipes Kimberly-Clark 34155 surgical wipes
Mapleson E Breathing Circuit VetEquip 921412
Methanol Fisher Scientific A412
Mobile Anesthesia Machine VetEquip 901805
Mouse on Mouse Basic Kit Vector Laboratories BMK-2202 mouse IgG blocking reagent
Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180
NAIR Hair remover lotion/oil Fisher Scientific NC0132811
NOD-Rag1null IL2rg null (NRG) mice The Jackson Laboratory 007799 2 to 3 months old
O.C.T. Compound Fisher Scientific 23-730-571
Oxygen Airgas OX USPEA
PBS (phosphate buffered saline) buffer Fisher Scientific 4870500
Povidone Iodine Prep Solution Dynarex 1415
ProLong™ Gold Antifade Mountant Fisher Scientific P10144 (no DAPI); P36935 (with DAPI)
Puralube Ophthalmic Ointment Dechra 17033-211-38
Rimadyl (carprofen) injectable Patterson Veterinary 10000319 surgical analgesic, administered subcutaneously at a dose of 5mg/kg
Scalpel Blades – #11 F.S.T 10011-00
Scalpel Handle – #3 F.S.T 10003-12
Stereo Microscope Accu-scope 3075
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Suture, Synthetic, Non-Absorbable, 30 inches long, CV-11 needle Covidien VP-706-X
1ml Syringe (26 gauge, 3/8 inch needle) BD Biosciences 329412
Trimmer Kent Scientific CL9990-KIT
Vannas Spring Scissors, 8.0 mm cutting edge F.S.T 15009-08
VaporGaurd Activated Charcoal Filter VetEquip 931401
Wound clips, 9 mm F.S.T 12022-09

References

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Cite This Article
Britson, K. A., Black, A. D., Wagner, K. R., Lloyd, T. E. Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice. J. Vis. Exp. (151), e59966, doi:10.3791/59966 (2019).

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