Summary

Modulazione della localizzazione subcellulare Tau come strumento per studiare l'espressione dei geni correlati alla malattia

Published: December 20, 2019
doi:

Summary

Il Tau è una proteina neuronale presente sia nel citoplasma, dove lega i microtubuli, sia nel nucleo, dove esercita funzioni non convenzionali tra cui la modulazione dei geni correlati alla malattia di Alzheimer. Qui, descriviamo un metodo per studiare la funzione del Tau nucleare escludendo eventuali interferenze provenienti da citoplasmatica Tau.

Abstract

Il Tau è una proteina legante di microtubuli espressa nei neuroni e la sua principale funzione nota è legata al mantenimento della stabilità citoscheletrica. Tuttavia, prove recenti hanno indicato che Tau è presente anche in altri compartimenti subcellulari, tra cui il nucleo in cui è implicato nella protezione del DNA, nella trascrizione del rRNA, nella mobilità dei retrotrasposoni e nell’organizzazione strutturale del nucleolus. Recentemente abbiamo dimostrato che il Tau nucleare è coinvolto nell’espressione del gene VGluT1, suggerendo un meccanismo molecolare che potrebbe spiegare l’aumento patologico del rilascio del glutammato nelle prime fasi del morbo di Alzheimer. Fino a poco tempo fa, il coinvolgimento del Tau nucleare nella modulazione dell’espressione dei geni bersaglio è stato relativamente incerto e ambiguo a causa di limitazioni tecniche che impedivano l’esclusione del contributo di Tau citoplasmico o dell’effetto di altri fattori a valle non correlati al Tau nucleare. Per superare questa incertezza, abbiamo sviluppato un metodo per studiare l’espressione di geni bersaglio specificamente modulati dalla proteina Nucleare Tau. Abbiamo impiegato un protocollo che afcoppia l’uso di segnali di localizzazione e la frazione subcellulare, consentendo l’esclusione dell’interferenza dalle molecole citoplasmiche Tau. In particolare, il protocollo è facile ed è composto da metodi classici e affidabili che sono ampiamente applicabili per studiare la funzione nucleare di Tau in altri tipi di cellule e condizioni cellulari.

Introduction

Le funzioni della proteina Tau nel nucleo hanno suscitato un notevole interesse negli ultimi anni, in quanto è stato dimostrato essere strettamente associato agli acidi nucleici1,2,3,4,5,6. Ineffetti, un recente studio a livello di genoma ha dimostrato che Tau lega sequenze di DNA genico e intergenico in vivo7. Un ruolo nell’organizzazione nucleolare è stato suggerito8,9,10,11. Inoltre, è stato proposto che Tau sia coinvolto nella protezione del DNA dallo stress ossidativo e ipertermico5,10,12,13, mentre Tau mutato è stato collegato all’instabilità cromosomica e all’aneuploidità14,15,16.

Fino ad ora, le sfide nello studio delle funzioni di Tau nel compartimento nucleare sono rimaste quasi irrisolte a causa delle difficoltà nel sezionare il contributo specifico del Tau nucleare dal contributo di Citoplasma Tau. Inoltre, le funzioni attribuite alle molecole Tau nel compartimento nucleare, fino ad ora, sono correlate solo perché mancano di una dimostrazione inequivocabile del coinvolgimento diretto delle proteine Nucleari Tau. Infatti, il coinvolgimento di Tau nella mobilità dei retrotrasposoni o nella trascrizione del rRNA o nella protezione del DNA11,12,17,18,19 potrebbe essere spiegato anche dal contributo di Tau citoplasmico o dall’effetto di altri fattori a valle non legati al Tau nucleare.

Qui, forniamo un metodo che può risolvere questo problema sfruttando una procedura classica per isolare il compartimento nucleare combinato con l’uso di costrutti Tau 0N4R etichettati con localizzazione nucleare (NLS) o segnali di esportazione nucleare (NES). Questo approccio elimina i complessi problemi relativi ai possibili artefatti dovuti alla fuoriuscita di molecole Tau dal compartimento citoplasmatico. Inoltre, i costrutti Tau-NLS e Tau-NES inducono l’arricchimento o l’esclusione delle molecole Tau dal compartimento nucleare, rispettivamente, fornendo controlli positivi e negativi per il coinvolgimento delle molecole nucleari Tau in una funzione specifica. Il protocollo è tecnicamente facile ed è composto da metodi classici e affidabili che sono ampiamente applicabili per studiare la funzione nucleare di Tau in altri tipi di cellule, differenziate o meno, come le cellule tumorali che riattivano l’espressione Tau20,21. Inoltre, potrebbe essere applicato anche ad altre proteine che sono presenti sia nel citoplasma che nel nucleo al fine di sezionare le funzioni biologiche relative a diversi compartimenti.

Protocol

1. Cultura cellulare Cellule SH-SY5Y di coltura (linea cellulare del neuroblastoma umano, CRL-2266) nel mezzo completo (Dulbecco’s modified Eagle medium:miscela nutritiva F12 [DMEM/F-12] completata con 10% di siero bovino fetale [FBS], 2 mM L-glutamina, 100 U/mL penicillina e 100 streptonomici). Mantenere le cellule in un’incubatrice a 37 e 5% di CO2. Crescere le cellule in piastre 10 cm e dividere quando confluente. 2. Differenziazione cellulare Per differ…

Representative Results

La strategia utilizzata per sezionare l’impatto del Tau nucleare nell’espressione genica evitando il contributo delle proteine Tau citoplasmiche è stata descritta nella Figura 1. In breve, le proteine Tau etichettate con NLS o NES vengono accumulate o escluse rispettivamente dal compartimento nucleare. L’effetto funzionale di questo squilibrio è l’alterazione dell’espressione genica misurata come prodotto del gene VGluT1. <p class="jove_content" fo:keep…

Discussion

Descriviamo un metodo per misurare l’impatto della proteina Tau nucleare sull’espressione genica. Con questo protocollo il contributo di Tau citoplasmatica è fortemente limitato. I passaggi critici di questo protocollo sono i seguenti: la differenziazione delle cellule umane del neuroblastoma SH-SY5Y, la frazione subcellulare e la localizzazione della proteina Tau nel compartimento nucleare.

In primo luogo, come mostrato nella sezione dei risultati rappresentativi, la differenziazione delle c…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni di Normale Scuola Superiore (SNS14_B_DIPRIMIO; SNS16_B_DIPRIMIO).

Materials

Alexa Fluor 633 goat anti-mouse IgG Life Technologies A21050 IF 1:500
anti Actin Antibody BETHYL LABORATORIE A300-485A anti-rabbit WB 1:10000
anti GAPDH Antibody Fitzgerald Industries International 10R-G109a anti-mouse WB 1:10000
anti H2B Antibody Abcam ab1790 anti-rabbit WB 1:15000
anti Tau-13 Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-21796 anti-mouse WB 1:1000; IF 1:500
anti Tubulin alpha Antibody Thermo Fisher Scientific PA5-16891 anti-mouse WB 1:5000
anti VGluT1 Antibody Sigma-Aldrich AMAb91041 anti-mouse WB 1:500
BCA Protein Assay Kit Euroclone EMPO14500
BDNF Alomone Labs B-250
Blotting-Grade Blocker Biorad 1706404 Non-fat dry milk
BOVIN SERUM ALBUMIN Sigma-Aldrich A4503-50g
cOmplete Mini Roche 11836170001 protease inhibitor
Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 well Biorad 5678093
DAPI Thermo Fisher Scientific 62247
DMEM/F-12 GIBCO 21331-020
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose Euroclone ECM0060L
EDTA Sigma-Aldrich 0390-100ml pH=8 0.5M
Foetal Bovine Serum Euroclone EC50182L
Glycerol Sigma-Aldrich G5516-500ml
Goat anti-mouse IgG-HPR Santa Cruz Biotechnology sc-2005 WB 1:1000
Goat anti-rabbit IgG-HPR Santa Cruz Biotechnology sc-2004 WB 1:1000
IGEPAL CA-630 Sigma-Aldrich I8896-50ml Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol
Immobilon Western MERCK WBKLS0500
Lab-Tech Chamber slide 8 well glass slide nunc 177402
L-glutamine Euroclone ECB3000D 100X
Lipofectamine 2000 transfection reagent Thermo Fisher Scientific 12566014 cationic lipid
Methanol Sigma-Aldrich 322415-6X1L
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266-100G
NaCl Sigma-Aldrich S3014-1kg
Opti-MEM reduced serum medium Gibco 31985070
PEI Sigma-Aldrich 40,872-7
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 10,000 U/ml, 100ml
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) OXOID BR0014G
PhosStop Roche 4906837001 phosphatase inhibitor
QIAGEN Plasmid Maxi Kit Qiagen 12163 Step 3.10
Retinoic acid Sigma-Aldrich R2625-100mg
Subcellular Protein Fractionation Kit for cultured cells Thermo Fisher Scientific 78840
Supported Nitrocellulose membrane Biorad 1620097
TC-Plate 6well SARSTEDT 833,920
TCS SP2 laser scanning confocal microscope Leica N/A
Triton x-100 Sigma-Aldrich X100-500ml Non-ionic surfactant
Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 15400054 0.50%
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416-100ml
VECTASHIELD antifade mounting medium Vector Laboratories H-1000
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems Promega A1330 Step 3.5

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Cite This Article
Siano, G., Caiazza, M. C., Varisco, M., Calvello, M., Quercioli, V., Cattaneo, A., Di Primio, C. Modulation of Tau Subcellular Localization as a Tool to Investigate the Expression of Disease-related Genes. J. Vis. Exp. (154), e59988, doi:10.3791/59988 (2019).

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