Modulação da localização subcelular tau como uma ferramenta para investigar a expressão de genes relacionados à doença

Summary

Tau é uma proteína neuronal presente tanto no citoplasma, onde liga microtúbulos, e no núcleo, onde exerce funções não convencionais, incluindo a modulação dos genes relacionados à doença de Alzheimer. Aqui, descrevemos um método para investigar a função do tau nuclear, excluindo quaisquer interferências provenientes de Tau citoplasmamic.

Abstract

Tau é uma proteína de ligação microtúnuo expressa nos neurônios e sua principal função conhecida está relacionada à manutenção da estabilidade citosquelética. No entanto, evidências recentes indicaram que Tau também está presente em outros compartimentos subcelulares, incluindo o núcleo onde está implicado na proteção do DNA, na transcrição do rRNA, na mobilidade de retrotransposons e na organização estrutural do Nucléolo. Recentemente, demonstramos que tau nuclear está envolvido na expressão do gene VGluT1, sugerindo um mecanismo molecular que poderia explicar o aumento patológico da liberação de glutamato nos estágios iniciais da doença de Alzheimer. Até recentemente, o envolvimento do tau nuclear na modulação da expressão de genes-alvo tem sido relativamente incerto e ambíguo devido a limitações técnicas que impediram a exclusão da contribuição de Tau citoplasmic ou o efeito de outros fatores a jusante não relacionados ao nuclear Tau. Para superar essa incerteza, desenvolvemos um método para estudar a expressão de genes-alvo especificamente modulados pela proteína tau nuclear. Nós empregamos um protocolo que acople o uso de sinais da localização e do fration subcellular, permitindo a exclusão da interferência das moléculas citoplasmômicas de Tau. Mais notavelmente, o protocolo é fácil e é composto por métodos clássicos e confiáveis que são amplamente aplicáveis para estudar a função nuclear de Tau em outros tipos de células e condições celulares.

Introduction

As funções da proteína Tau no núcleo têm atraído interesse significativo nos últimos anos, uma vez que tem se mostrado intimamente associada com os ácidos nucleicos^1,2,3,4,5,6. Na verdade, um estudo recente em todo o genoma demonstrou que Tau liga seqüências de DNA genic e intergênicos in vivo⁷. Um papel na organização nucleolar foi sugerido^8,9,10,11. Além disso, Tau foi proposto para se envolver na proteção do DNA contra o estresse oxidativo e hipertermiômico^5,10,12,13, enquanto tau mutado tem sido associada à instabilidade cromossômica e aneuploide^14,15,16.

Até agora, os desafios em estudar as funções de Tau no compartimento nuclear permaneceram quase sem solução devido às dificuldades em dissecar a contribuição específica de Tau nuclear da contribuição de Tau citoplasmic. Além disso, as funções atribuídas às moléculas tau no compartimento nuclear, até agora, são apenas correlativas porque não têm uma demonstração inequívoca do envolvimento direto das proteínas nucleares Tau. De fato, o envolvimento de Tau na mobilidade de retrotransposons ou na transcrição rRNA ou na proteção do DNA^{11,12,17,18,19} também pode ser explicado pela contribuição de Tau citoplasmic ou pelo efeito de outros fatores a jusante não relacionados ao nuclear Tau.

Aqui, fornecemos um método que pode resolver este problema explorando um procedimento clássico para isolar o compartimento nuclear combinado com o uso de tau constrói 0N4R marcado com localização nuclear (NLS) ou sinais de exportação nuclear (NES). Esta abordagem elimina as questões complexas relacionadas com possíveis artefatos devido à repercussão das moléculas tau do compartimento citoplasmático. Além disso, as construções Tau-NLS e Tau-NES induzem o enriquecimento ou a exclusão das moléculas tau do compartimento nuclear, respectivamente, fornecendo controles positivos e negativos para o envolvimento de moléculas nucleares tau em uma função específica. O protocolo é tecnicamente fácil e é composto por métodos clássicos e confiáveis que são amplamente aplicáveis ao estudo da função nuclear de Tau em outros tipos de células, diferenciados ou não, como células cancerosas que reativam a expressão tau^20,21. Além disso, pode ser aplicado também a outras proteínas que estão presentes tanto no citoplasma quanto no núcleo, a fim de dissecar funções biológicas relacionadas a diferentes compartimentos.

Protocol

1. Cultura celular Células Cultura SH-SY5Y (linha de células neuroblastoma humanas, CRL-2266) em meio completo (o meio modificado eagle de Dulbecco:mistura de nutrientes F12 [DMEM/F-12] complementada com 10% de soro bovino fetal [FBS], 2 mM L-glutamina, 100 U/mL penicilina e 100 μg/mL estreptomicina). Manter as células em uma incubadora a 37 °C e 5% CO2. Crescer as células em placas de 10 cm e dividir quando confluent. 2. Diferenciação celular Para …

Representative Results

A estratégia utilizada para dissecar o impacto do tau nuclear na expressão gênica evitando a contribuição de proteínas tau citoplasmasais tem sido retratada na Figura 1. Resumidamente, as proteínas Tau marcadas com NLS ou NES são acumuladas ou excluídas do compartimento nuclear, respectivamente. O efeito funcional deste desequilíbrio é a alteração da expressão gênica medida como produto do gene VGluT1. <p class="jove_content" fo:keep-togeth…

Discussion

Descrevemos um método para medir o impacto da proteína tau nuclear na expressão gênica. Com este protocolo, a contribuição do tau citoplasmic é fortemente limitada. Os passos críticos deste protocolo são os seguintes: a diferenciação das células neuroblastoma humana SH-SY5Y, o fracionamento subcelular e a localização da proteína Tau no compartimento nuclear.

Primeiro, como mostrado na seção de resultados representativos, a diferenciação das células SH-SY5Y, adicionando RA e…

Materials

Alexa Fluor 633 goat anti-mouse IgG	Life Technologies	A21050	IF 1:500
anti Actin Antibody	BETHYL LABORATORIE	A300-485A	anti-rabbit WB 1:10000
anti GAPDH Antibody	Fitzgerald Industries International	10R-G109a	anti-mouse WB 1:10000
anti H2B Antibody	Abcam	ab1790	anti-rabbit WB 1:15000
anti Tau-13 Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-21796	anti-mouse WB 1:1000; IF 1:500
anti Tubulin alpha Antibody	Thermo Fisher Scientific	PA5-16891	anti-mouse WB 1:5000
anti VGluT1 Antibody	Sigma-Aldrich	AMAb91041	anti-mouse WB 1:500
BCA Protein Assay Kit	Euroclone	EMPO14500
BDNF	Alomone Labs	B-250
Blotting-Grade Blocker	Biorad	1706404	Non-fat dry milk
BOVIN SERUM ALBUMIN	Sigma-Aldrich	A4503-50g
cOmplete Mini	Roche	11836170001	protease inhibitor
Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 well	Biorad	5678093
DAPI	Thermo Fisher Scientific	62247
DMEM/F-12	GIBCO	21331-020
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose	Euroclone	ECM0060L
EDTA	Sigma-Aldrich	0390-100ml	pH=8 0.5M
Foetal Bovine Serum	Euroclone	EC50182L
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516-500ml
Goat anti-mouse IgG-HPR	Santa Cruz Biotechnology	sc-2005	WB 1:1000
Goat anti-rabbit IgG-HPR	Santa Cruz Biotechnology	sc-2004	WB 1:1000
IGEPAL CA-630	Sigma-Aldrich	I8896-50ml	Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol
Immobilon Western	MERCK	WBKLS0500
Lab-Tech Chamber slide 8 well glass slide	nunc	177402
L-glutamine	Euroclone	ECB3000D	100X
Lipofectamine 2000 transfection reagent	Thermo Fisher Scientific	12566014	cationic lipid
Methanol	Sigma-Aldrich	322415-6X1L
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266-100G
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014-1kg
Opti-MEM reduced serum medium	Gibco	31985070
PEI	Sigma-Aldrich	40,872-7
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	10,000 U/ml, 100ml
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A)	OXOID	BR0014G
PhosStop	Roche	4906837001	phosphatase inhibitor
QIAGEN Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12163	Step 3.10
Retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625-100mg
Subcellular Protein Fractionation Kit for cultured cells	Thermo Fisher Scientific	78840
Supported Nitrocellulose membrane	Biorad	1620097
TC-Plate 6well	SARSTEDT	833,920
TCS SP2 laser scanning confocal microscope	Leica	N/A
Triton x-100	Sigma-Aldrich	X100-500ml	Non-ionic surfactant
Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	15400054	0.50%
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416-100ml
VECTASHIELD antifade mounting medium	Vector Laboratories	H-1000
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems	Promega	A1330	Step 3.5