Optisk clearing og Imaging av Immunolabeled nyre tissue
Summary
Kombinasjonen av antistoff merking, optisk clearing, og avansert lys mikroskopi tillater tredimensjonal analyse av komplette strukturer eller organer. Beskrevet her er en enkel metode for å kombinere immunolabeling av tykke nyre skiver, optisk clearing med etanol Cinnamate, og konfokalmikroskopi Imaging som muliggjør visualisering og kvantifisering av tredimensjonale nyre strukturer.
Abstract
Optiske clearing teknikker gjengi vev gjennomsiktig ved equilibrating brytningsindeksen gjennom en prøve for påfølgende tredimensjonale (3D) Imaging. De har fått stor oppmerksomhet i alle forskningsområder for potensialet til å analysere mikroskopiske flercellede strukturer som strekker seg over makroskopisk avstander. Gitt at nyre tubuli, blodkar, nerver, og glomeruli strekker seg i mange retninger, som bare er delvis tatt til fange av tradisjonelle todimensjonale teknikker så langt, har vevs avregning også åpnet mange nye områder av nyre forskning. Listen over optiske clearing metoder er raskt voksende, men det er fortsatt vanskelig for nybegynnere i dette feltet for å velge den beste metoden for en gitt forskningsspørsmål. Forutsatt her er en enkel metode som kombinerer antistoff merking av tykk mus nyre skiver; optisk clearing med billig, ikke-giftig og klar til bruk kjemiske etanol Cinnamate; og konfokalmikroskopi avbildning. Denne protokollen beskriver hvordan å perfuse nyrer og bruke et antigen-henting trinn for å øke antistoffer-binding uten å kreve spesialisert utstyr. Dens anvendelse er presentert i Imaging forskjellige flercellede strukturer i nyrene, og hvordan du feilsøker dårlig antistoff penetrasjon inn i vevet er adressert. Vi diskuterer også de potensielle vanskelighetene med Imaging endogene fluorophores og anskaffe svært store prøver og hvordan å overvinne dem. Denne enkle protokollen gir en lett-å-setup og omfattende verktøy for å studere vev i tre dimensjoner.
Introduction
Den økende interessen for å studere hele organer eller store flercellede strukturer har ført til utviklingen av optiske clearing metoder som involverer Imaging av transparent vev i tre dimensjoner. Inntil nylig har de beste metodene for å anslå celle nummer, lengde eller volum av hele strukturer vært stereology eller uttømmende seriell snitting, som er basert på systemisk prøvetaking av vev for påfølgende analyse i to dimensjoner1, 2 andre priser , 3. men disse metodene er tidkrevende og trenger et høyt nivå av trening og kompetanse4. Optiske clearing metoder overvinne disse problemene ved å equilibrating brytningsindeksen gjennom en prøve for å gjøre vevet gjennomskinnelig for 3-D Imaging5,6,7.
Flere optiske clearing metoder har blitt utviklet som faller inn i to hovedkategorier: løsemiddelbasert og vandig-baserte metoder. Vandige-baserte metoder kan videre deles inn i enkle nedsenking8,9, hyperhydration10,11, og hydrogel embedding12,13. Løsningsmiddelbasert metoder tørke vevet, fjerner lipider og normaliserer brytningsindeksen til en verdi rundt 1,55. Begrensninger av de fleste løsemiddel-baserte metoder er slukke endogene fluorescens av ofte brukte reporter proteiner som GFP, løsemiddel toksisitet, kapasitet til å oppløse lim brukes i noen tenkelig kamre eller objektiv linser, og krymping av vev under dehydrering14,15,16,17,18,19,20,21. Løsemiddelbasert metoder er imidlertid enkle, tidseffektive og kan fungere i en rekke forskjellige vevstyper.
Vandige-baserte metoder er avhengige av nedsenking av vevet i vandige løsninger som har brytnings indekser i området 1.38-1.528,11,12,22,23,24 . Disse metodene ble utviklet for å bevare endogene fluorescerende reporter protein utslipp og hindre dehydrering-indusert krymping, men begrensningene for de fleste vandige-baserte clearing metoder inkluderer en lengre varighet av protokollen, vev ekspansjon, og protein modifisering (dvs. delvis denaturering av proteiner ved urea i hyperhydrating protokoller som SCALea2)7,11,23,25. SCALeS adressert vev ekspansjon ved å kombinere urea med Sorbitol, som counterbalances ved dehydrering den urea-indusert vev ekspansjon, og bevart vevet Ultrastructure som evaluert av elektron mikroskopi10. Vev krymping eller ekspansjon påvirker absolutte størrelser av strukturer, avstander mellom objekter, eller celle tetthet per volum; Dermed kan måling av størrelsen endringer på clearing av vevet bidra til å tolke de oppnådde resultatene7,26.
Generelt består en protokoll for optisk lysning av flere trinn, inkludert forbehandling, permeabilization, immunolabeling (om nødvendig), brytningsindeks samsvar og bildebehandling med avansert lys mikroskopi (f.eks. to-Foton, konfokalmikroskopi eller lys-ark fluorescens mikroskopi). Mesteparten av clearing tilnærminger har blitt utviklet for å visualisere neuronal vev, og nye studier har validert deres anvendelse i andre organer5. Dette omfattende verktøyet er tidligere demonstrert for å muliggjøre pålitelig og effektiv analyse av nyre strukturer, inkludert glomeruli, immun infiltrerer28, blodkar28og tubule segmenter 29, og det er en ideell tilnærming til bedre forståelse av glomerulær funksjon og tubule remodeling i helse og sykdom.
Oppsummert her er en løsemiddelbasert metode som kombinerer immunostaining av nyre tubuli; optisk clearing med billig, ikke-giftig, og klar til bruk kjemisk etanol Cinnamate (tidlig intervensjon); og konfokalmikroskopi mikroskopi avbildning som gir full tubule visualisering og kvantifisering. Denne metoden er enkel, kombinerer antigen-gjenfinning av nyre skiver med flekker av kommersielle antistoffer, og krever ikke spesialisert utstyr, som gjør det tilgjengelig for de fleste laboratorier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Optisk clearing teknikker har fått bred oppmerksomhet for 3-D visualisering og kvantifisering av microanatomy i ulike organer. Løsemiddelbasert avregnings metode (tidlig intervensjon) ble kombinert med immunolabeling for 3-D bildebehandling av hele tubuli i nyre skiver. Denne metoden er enkel, billig og rask. Imidlertid, annet forskning spørsmål kanskje være best besvart med annet oppryddingen protokoller5. Det er også viktig å huske på at løsningsmiddelbasert metoder forårsaker vevs svi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
T. S. støttes av tilskudd fra DFG tyske forskningsstiftelse (332853055), Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2015_A197), og det medisinske fakultet i RWTH Aachen (RWTH Returner program). V. G. P. støttes av stipendiat stillinger fra Deutsche Gesellschaft pels Nephrologie, Alexander von Humboldt Foundation, og National Health and Medical Research Council of Australia. D. H. E støttes av Fondation LeDucq. R. K. er støttet av tilskudd fra DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), staten Northrhinewestfalia (MIWF-NRW) og tverrfaglig senter for klinisk forskning ved RWTH Aachen University (O3-11).
Materials
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-761-112 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | 339650 | |
| 21 gauge butterfly needle | Braun | Venofix | |
| 3-way stopcock | Fisher Scientific | K420163-4503 | |
| 3D analyis software | Bitplane AG | IMARIS | |
| 3D analyis software | Cellprofiler | free open-source software | |
| 5-0 silk suture | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| 50 ml plastic syringes | Fisher Scientific | 14-817-57 | |
| Anti-BrdU monoclonal antibody | Roche | 11296736001 | |
| Antibody diluent | Dako | S0809 | |
| CD31-647 | BioLegend | 102516 | |
| Citrate-based antigen retrieval solution | Vector Laboratories | H-3300 | |
| curved hemostat | Fisher Scientific | 13-812-14 | |
| Dako Wash Buffer | Agilent | S3006 | |
| dissecting microscope | Motic | DSK-500 | |
| Embedding cassettes | Carl Roth | E478.1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethyl cinnamate | Sigma-Aldrich | 112372 | |
| Flexible film/Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Goat anti-AQP2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-9882 | |
| Guinea pig anti-NKCC2 | N/A | N/A | DOI: 10.1681/ASN.2012040404 |
| HCl | Carl Roth | P074.1 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | 401-02 | |
| hemostat | Agnthos | 312-471-140 | |
| horizontal rocker | Labnet | S2035-E | |
| Imaging dish | Ibidi | 81218 | |
| Ketamine | MWI Animal Health | 501090 | |
| Micro serrefine | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Operating scissors | Merit | 97-272 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fischer Scientific | O4042-500 | |
| Rabbit anti-phoshoThr53-NCC | PhosphoSolutions | p1311-53 | |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments Kwik-Sil | KWIK-SIL | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Tissue slicer | Zivic Instruments | HSRA001-1 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | AC215682500 | |
| Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vibratome | Lancer | Series 1000 | |
| Xylazine | MWI Animal Health | AnaSed Inj SA (Xylazine) |
References
- Oh, S. W., et al. A mesoscale connectome of the mouse brain. Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).
- Zhai, X. Y., et al. 3-D reconstruction of the mouse nephron. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (1), 77-88 (2006).
- Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
- Puelles, V. G., Bertram, J. F., Moeller, M. J. Quantifying podocyte depletion: theoretical and practical considerations. Cell and Tissue Research. 369 (1), 229-236 (2017).
- Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).
- Ariel, P. A beginner’s guide to tissue clearing. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Lee, E., Sun, W. ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: 3-D visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Erturk, A., et al. 3-D imaging of solvent-cleared organs using 3-DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PloS One. 7 (3), e33916 (2012).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS ONE. 10 (5), e0124650 (2015).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. 2,2′-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy. Microscopy Research and Technique. 70 (1), 1-9 (2007).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Hua, L., Zhou, R., Thirumalai, D., Berne, B. J. Urea denaturation by stronger dispersion interactions with proteins than water implies a 2-stage unfolding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (44), 16928-16933 (2008).
- Wan, P., et al. Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain. Neurophotonics. 5 (3), 035007 (2018).
- Puelles, V. G., et al. Validation of a 3-D Method for Counting and Sizing Podocytes in Whole Glomeruli. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (10), 3093-3104 (2016).
- Puelles, V. G. Novel 3-D analysis using optical tissue clearing documents the evolution of murine rapidly progressive glomerulonephritis. Kidney International (in press). , (2019).
- Saritas, T., et al. Optical Clearing in the Kidney Reveals Potassium-Mediated Tubule Remodeling. Cell Reports. 25 (10), 2668-2675 (2018).
- Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146 (3), (2019).
- Clark, J. Z., et al. Representation and relative abundance of cell-type selective markers in whole-kidney RNA-Seq data. Kidney International. 95 (4), 787-796 (2019).
- Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5 (1), eaau8355 (2019).
- Sylwestrak, E. L., Rajasethupathy, P., Wright, M. A., Jaffe, A., Deisseroth, K. Multiplexed Intact-Tissue Transcriptional Analysis at Cellular Resolution. Cell. 164 (4), 792-804 (2016).
- Shah, S., et al. Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing. Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).
- Gleave, J. A., Lerch, J. P., Henkelman, R. M., Nieman, B. J. A method for 3-D immunostaining and optical imaging of the mouse brain demonstrated in neural progenitor cells. PLoS ONE. 8 (8), e72039 (2013).
- Saritas, T., et al. Disruption of CUL3-mediated ubiquitination causes proximal tubule injury and kidney fibrosis. Scientific Reports. 9 (1), 4596 (2019).
- Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. Multiphoton imaging of the functioning kidney. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (7), 1297-1304 (2011).
- Holliger, P., Hudson, P. J. Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nature Biotechnology. 23 (9), 1126-1136 (2005).
- Bunka, D. H., Stockley, P. G. Aptamers come of age – at last. Nature Reviews: Microbiology. 4 (8), 588-596 (2006).
- Kim, S. Y., et al. Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), E6274-E6283 (2015).
- Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C., Gentleman, S. M. Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for 3-D visualization of human brain tissues. Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).
- Xu, N., et al. Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of 3-D brain tissue. Scientific Reports. 7 (1), 9895 (2017).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Matryba, P., Bozycki, L., Pawlowska, M., Kaczmarek, L., Stefaniuk, M. Optimized perfusion-based CUBIC protocol for the efficient whole-body clearing and imaging of rat organs. Journal of Biophotonics. 11 (5), e201700248 (2018).
