Сочетание маркировки антител, оптической очистки и передовой световой микроскопии позволяет трехмерный анализ полных структур или органов. Описанный здесь простой метод для объединения иммуномаркировки толстых ломтиков почек, оптическая очистка с этиловый циннамат, и конфокальная визуализация, которая позволяет визуализации и количественной оценки трехмерных структур почек.
Методы оптической очистки делают ткань прозрачной, уравновешись рефракционным индексом во всем образце для последующего трехмерного (3-D) изображения. Они получили большое внимание во всех областях исследований для потенциального анализа микроскопических многоклеточных структур, которые простираются на макроскопические расстояния. Учитывая, что почечные трубочки, сосуды, нервы и гломерули распространяются во многих направлениях, которые были лишь частично захвачены традиционными двумерными методами до сих пор, очистка тканей также открыла много новых областей исследований почек. Список методов оптической очистки быстро растет, но новичкам в этой области по-прежнему трудно выбрать наилучший метод для заданного исследовательского вопроса. При условии, здесь простой метод, который сочетает в себе антитела маркировки толстых ломтиков мыши почки; оптическая очистка с дешевым, нетоксичным и готовым к использованию химическим этилцином; и конфокальной визуализации. Этот протокол описывает, как пронзать почки и использовать антиген-поиск шаг для увеличения антитела-связывания, не требуя специализированного оборудования. Его применение представлено в визуализации различных многоклеточных структур в почках, и как устранить неполадки плохое проникновение антител в ткани рассматривается. Мы также обсуждаем потенциальные трудности визуализации эндогенных флюорофоров и приобретения очень больших образцов и как их преодолеть. Этот простой протокол обеспечивает простой в настройке и всеобъемлющий инструмент для изучения тканей в трех измерениях.
Растущий интерес к изучению целых органов или крупных многоклеточных структур привел к разработке методов оптической очистки, которые включают визуализацию прозрачной ткани в трех измерениях. До недавнего времени лучшими методами оценки количества клеток, длины или объема целых структур были стереология или исчерпывающее последовательное секционирование, которое основано на системной выборке ткани для последующего анализа в двух измерениях1, 2 , 3. Однако эти методы отнимают много времении нуждаются в высоком уровне подготовки и опыта 4. Методы оптической очистки преодолевают эти проблемы, уравновешивает рефракционный индекспо всему образцу, чтобы сделать ткани полупрозрачными для 3-D изображения 5,6,7.
Разработано несколько методов оптической очистки, которые подпадают под две основные категории: методы на основе растворителя и aqueous. Методы на основе aqueous можно далееразделить на простое погружение 8,9,гипергидратацию10,11и гидрогель встраивание12,13. Методы на основе растворов обезвоживают ткани, удаляют липиды и нормализуют рефракционный индекс до значения около 1,55. Ограничения большинства методов на основе растворителя являются уторение эндогенной флуоресценции широко используемых белков репортера, таких как GFP, токсичность растворителя, способность растворять клеи, используемые в некоторых камерах изображения или объективных линзах, и усадка тканей во время обезвоживание14,15,16,17,18,19,20,21. Тем не менее, методы на основе растворителя просты, экономичны по времени и могут работать в различных типах тканей.
Aqueous-основанные методы полагаются на погружении ткани в aqueous разрешения которые имеют рефракционные indicesв ряде 1.38-1.52 8,11,12,22,23,24 . Эти методы были разработаны для сохранения эндогенных флуоресцентных белков ырепортера и предотвращения усадки, вызванной обезвоживанием, но ограничения большинства вспомогательных методов очистки включают более длительную продолжительность протокола, расширение тканей и белковая модификация (т.е. частичная денатурация белков мочевиной в протоколах гипергидратации, таких как ScaleA2) 7,11,23,25. ScaleS обратился к расширению тканей путем объединения мочевины с сорбитол, который уравновешивает путем обезвоживания мочевины индуцированной ткани расширения, и сохранил ткани ультраструктуры, как оценивается электронной микроскопии10. Усадка или расширение тканей влияет на абсолютные размеры структур, расстояния между объектами или плотность клеток на объем; Таким образом, измерение изменений размера при очисткеткани может помочь интерпретировать полученные результаты 7,26.
В целом, протокол оптической очистки состоит из нескольких этапов, включая предварительную обработку, permeabilization, иммуномаркировку (при необходимости), соответствие рефракционного индекса и визуализацию с продвинутой световой микроскопией (например, двухфотон, confocal, или светлистой флуоресценции микроскопии). Большинство подходов к очистке были разработаны для визуализации нейронной ткани, и новые исследования подтвердили их применение в других органах5. Этот комплексный инструмент был ранее продемонстрирован, чтобы обеспечить надежный и эффективный анализ структур почек, в том числе glomeruli27,28, иммунные инфильтраты28, сосуды28, и тулупер сегментов 29, и это идеальный подход к лучшему пониманию гломерулярной функции и переделки трубок в области здоровья и болезней.
Обобщен здесь метод на основе растворителя, который сочетает в себе иммуностогирование почечных труб; оптическая очистка с дешевым, нетоксичным и готовым к использованию химическим этилцином (ECi); и конфокальная микроскопическая визуализация, которая позволяет полную визуализацию и количественную оценку труб. Этот метод прост, сочетает в себе антиген-извлечение ломтиков почек с окрашиванием коммерческих антител, и не требует специализированного оборудования, что делает его доступным для большинства лабораторий.
Методы оптической очистки получили широкое внимание для трехмерной визуализации и количественной оценки микроанатомии в различных органах. Здесь метод очистки на основе растворителя (ECi) сочетался с иммуномаркировкой для трех-D-изображения целых трубок в почках. Этот метод прост, недо…
The authors have nothing to disclose.
Т. С. поддерживается грантами немецкого исследовательского фонда DFG (332853055), Else Kr’ner-Fresenius-Stiftung (2015-A197) и медицинским факультетом RWTH Aachen (Программа RWTH Returner). V. G. P. поддерживается научными стипендиями от Deutsche Gesellschaft меха Nephrologie, Александр фон Гумбольдт Фонда, и Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям Австралии. D. H. E поддерживается Фондом LeDucq. Р. К. поддерживается грантами DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), штата СеверныйВестфалия (MIWF-NRW) и Междисциплинарного центра клинических исследований при Университете RWTH Aachen (O3-11).
0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-761-112 | |
15 mL conical tube | Fisher Scientific | 339650 | |
21 gauge butterfly needle | Braun | Venofix | |
3-way stopcock | Fisher Scientific | K420163-4503 | |
3D analyis software | Bitplane AG | IMARIS | |
3D analyis software | Cellprofiler | free open-source software | |
5-0 silk suture | Fine Science Tools | 18020-50 | |
50 ml plastic syringes | Fisher Scientific | 14-817-57 | |
Anti-BrdU monoclonal antibody | Roche | 11296736001 | |
Antibody diluent | Dako | S0809 | |
CD31-647 | BioLegend | 102516 | |
Citrate-based antigen retrieval solution | Vector Laboratories | H-3300 | |
curved hemostat | Fisher Scientific | 13-812-14 | |
Dako Wash Buffer | Agilent | S3006 | |
dissecting microscope | Motic | DSK-500 | |
Embedding cassettes | Carl Roth | E478.1 | |
Ethanol | Merck | 100983 | |
Ethyl cinnamate | Sigma-Aldrich | 112372 | |
Flexible film/Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
Goat anti-AQP2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-9882 | |
Guinea pig anti-NKCC2 | N/A | N/A | DOI: 10.1681/ASN.2012040404 |
HCl | Carl Roth | P074.1 | |
Heparin | Sagent Pharmaceuticals | 401-02 | |
hemostat | Agnthos | 312-471-140 | |
horizontal rocker | Labnet | S2035-E | |
Imaging dish | Ibidi | 81218 | |
Ketamine | MWI Animal Health | 501090 | |
Micro serrefine | Fine Science Tools | 18052-03 | |
NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
Operating scissors | Merit | 97-272 | |
Paraformaldehyde | Thermo Fischer Scientific | O4042-500 | |
Rabbit anti-phoshoThr53-NCC | PhosphoSolutions | p1311-53 | |
Silicone elastomer | World Precision Instruments Kwik-Sil | KWIK-SIL | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Tissue slicer | Zivic Instruments | HSRA001-1 | |
Triton X-100 | Acros Organics | AC215682500 | |
Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
Vibratome | Lancer | Series 1000 | |
Xylazine | MWI Animal Health | AnaSed Inj SA (Xylazine) |