Limpieza óptica e imágenes del tejido renal inmunoetiquetado
Summary
La combinación de etiquetado de anticuerpos, limpieza óptica y microscopía de luz avanzada permite el análisis tridimensional de estructuras u órganos completos. Aquí se describe un método sencillo para combinar la inmunoetiquetado de rodajas renales gruesas, la limpieza óptica con la canela etílico y la imagen confocal que permite la visualización y cuantificación de estructuras renales tridimensionales.
Abstract
Las técnicas de limpieza óptica hacen que el tejido sea transparente equilibrando el índice de refracción a lo largo de una muestra para imágenes tridimensionales posteriores (3-D). Han recibido gran atención en todas las áreas de investigación por el potencial de analizar estructuras microscópicas multicelulares que se extienden a lo largo de distancias macroscópicas. Dado que los túbulos renales, la vasculatura, los nervios y los glomérulos se extienden en muchas direcciones, que sólo han sido capturados parcialmente por técnicas bidimensionales tradicionales hasta el momento, la limpieza de tejidos también abrió muchas nuevas áreas de investigación renal. La lista de métodos de compensación óptica está creciendo rápidamente, pero sigue siendo difícil para los principiantes en este campo elegir el mejor método para una pregunta de investigación dada. Aquí se proporciona un método simple que combina el etiquetado de anticuerpos de rebanadas gruesas de riñón de ratón; limpieza óptica con canela etílico química barata, no tóxica y lista para usar; e imágenes confocales. Este protocolo describe cómo perfumar los riñones y utilizar un paso de recuperación de antígenos para aumentar la unión de anticuerpos sin necesidad de equipos especializados. Su aplicación se presenta en imágenes de diferentes estructuras multicelulares dentro del riñón, y se aborda cómo solucionar la mala penetración de anticuerpos en el tejido. También discutimos las posibles dificultades de la toma de imágenes de fluoróforos endógenos y la adquisición de muestras muy grandes y cómo superarlas. Este sencillo protocolo proporciona una herramienta completa y fácil de configurar para estudiar el tejido en tres dimensiones.
Introduction
El creciente interés en estudiar órganos enteros o grandes estructuras multicelulares ha llevado al desarrollo de métodos de limpieza óptica que implican imágenes de tejido transparente en tres dimensiones. Hasta hace poco, los mejores métodos para estimar el número de células, la longitud o el volumen de estructuras enteras han sido la estereología o la sección serial exhaustiva, que se basa en el muestreo sistémico de tejido para su posterior análisis en dos dimensiones1, 2 , 3. Sin embargo, estos métodos consumen mucho tiempo y necesitan un alto nivel de formación y experiencia4. Los métodos de limpieza óptica superan estos problemas equilibrando el índice de refracción a lo largo de una muestra para hacer que el tejido sea translúcido para imágenes 3D5,6,7.
Se han desarrollado varios métodos de compensación óptica que se dividen en dos categorías principales: métodos basados en disolventes y acuosos. Los métodos acuosos se pueden dividir aún más en una inmersión simple8,9, hiperhidratación10,11,e hidrogel incrustando12,13. Los métodos a base de disolventes deshidratan el tejido, eliminan los lípidos y normalizan el índice de refracción a un valor alrededor de 1,55. Las limitaciones de la mayoría de los métodos basados en disolventes son el enfriamiento de la fluorescencia endógena de proteínas de reportero de uso común como GFP, toxicidad de disolventes, capacidad para disolver los pegamentos utilizados en algunas cámaras de imágenes u lentes objetivas, y contracción del tejido durante deshidratación14,15,16,17,18,19,20,21. Sin embargo, los métodos basados en disolventes son simples, eficientes en el tiempo y pueden funcionar en varios tipos de tejidos diferentes.
Los métodos acuosos se basan en la inmersión del tejido en soluciones acuosas que tienen índicesrefractivos en el rango de 1,38-1,52 8,11,12,22,23,24 . Estos métodos fueron desarrollados para preservar la emisión de proteínas fluorescentes endógenas de reportero y prevenir la contracción inducida por la deshidratación, pero las limitaciones de la mayoría de los métodos de limpieza a base acuosa incluyen una mayor duración del protocolo, expansión de tejidos y modificación proteica (es decir, desnaturalización parcial de proteínas por urea en protocolos hiperhidratantes como ScaleA2)7,11,23,25. ScaleS abordó la expansión del tejido mediante la combinación de urea con sorbitol, que contrarresta por deshidratación la expansión del tejido inducida por la urea, y preserva la ultraestructura del tejido según lo evaluado por la microscopía electrónica10. La contracción o expansión del tejido afecta a los tamaños absolutos de las estructuras, las distancias entre los objetos o la densidad celular por volumen; por lo tanto, la medición de los cambios de tamaño al limpiar el tejido puede ayudar a interpretar los resultados obtenidos7,26.
En general, un protocolo para la compensación óptica consta de múltiples pasos, incluyendo pretratamiento, permeabilización, inmunoetiquetado (si es necesario), coincidencia de índices de refracción e imágenes con microscopía de luz avanzada (por ejemplo, bitótno, confocal o microscopía de fluorescencia de láminas de luz). La mayoría de los enfoques de limpieza se han desarrollado para visualizar el tejido neuronal, y estudios emergentes han validado su aplicación en otros órganos5. Esta completa herramienta se ha demostrado previamente para permitir un análisis fiable y eficiente de las estructuras renales, incluyendo glomérulos27,28, infiltrados inmunes28, vasculatura28,y segmentos de túbulos 29, y es un enfoque ideal para mejorar la comprensión de la función glomerular y la remodelación de túbulos en salud y enfermedades.
Aquí se resume un método a base de disolvente que combina inmunomanchado de túbulos renales; limpieza óptica con canela etílico química barata, no tóxica y lista para usar (ECi); y la imagen por microscopía confocal que permite la visualización y cuantificación completa de los túbulos. Este método es simple, combina la recuperación de antígenos de rodajas de riñón con la tinción de anticuerpos comerciales, y no requiere equipo especializado, lo que lo hace accesible a la mayoría de los laboratorios.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las técnicas de limpieza óptica han recibido una amplia atención para la visualización tridimensional y la cuantificación de la microanatomía en diversos órganos. Aquí, el método de limpieza a base de disolventes (ECi) se combinó con el inmunoetiquetado para imágenes tridimensionales de túbulos enteros en rodajas renales. Este método es simple, barato y rápido. Sin embargo, otras preguntas de investigación pueden ser mejor respondidas con otros protocolos de compensación5. También…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
T. S. cuenta con el apoyo de subvenciones de la DFG German Research Foundation (332853055), Else Kr’ner-Fresenius-Stiftung (2015_A197) y la Facultad de Medicina de la RWTH Aachen (Programa de Retorno RWTH). V. G. P. cuenta con el apoyo de becas de investigación de Deutsche Gesellschaft fur Nephrologie, la Fundación Alexander von Humboldt y el Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica de Australia. D. H. E es apoyado por la Fundación LeDucq. R. K. cuenta con el apoyo de subvenciones del DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), el Estado de Northrhinewestfalia (MIWF-NRW) y el Centro Interdisciplinario de Investigación Clínica de la Universidad RWTH Aachen (O3-11).
Materials
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-761-112 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | 339650 | |
| 21 gauge butterfly needle | Braun | Venofix | |
| 3-way stopcock | Fisher Scientific | K420163-4503 | |
| 3D analyis software | Bitplane AG | IMARIS | |
| 3D analyis software | Cellprofiler | free open-source software | |
| 5-0 silk suture | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| 50 ml plastic syringes | Fisher Scientific | 14-817-57 | |
| Anti-BrdU monoclonal antibody | Roche | 11296736001 | |
| Antibody diluent | Dako | S0809 | |
| CD31-647 | BioLegend | 102516 | |
| Citrate-based antigen retrieval solution | Vector Laboratories | H-3300 | |
| curved hemostat | Fisher Scientific | 13-812-14 | |
| Dako Wash Buffer | Agilent | S3006 | |
| dissecting microscope | Motic | DSK-500 | |
| Embedding cassettes | Carl Roth | E478.1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethyl cinnamate | Sigma-Aldrich | 112372 | |
| Flexible film/Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Goat anti-AQP2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-9882 | |
| Guinea pig anti-NKCC2 | N/A | N/A | DOI: 10.1681/ASN.2012040404 |
| HCl | Carl Roth | P074.1 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | 401-02 | |
| hemostat | Agnthos | 312-471-140 | |
| horizontal rocker | Labnet | S2035-E | |
| Imaging dish | Ibidi | 81218 | |
| Ketamine | MWI Animal Health | 501090 | |
| Micro serrefine | Fine Science Tools | 18052-03 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Operating scissors | Merit | 97-272 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fischer Scientific | O4042-500 | |
| Rabbit anti-phoshoThr53-NCC | PhosphoSolutions | p1311-53 | |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments Kwik-Sil | KWIK-SIL | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Tissue slicer | Zivic Instruments | HSRA001-1 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | AC215682500 | |
| Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vibratome | Lancer | Series 1000 | |
| Xylazine | MWI Animal Health | AnaSed Inj SA (Xylazine) |
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