Kinetisk screening af Nukleaseaktivitet ved hjælp af nukleinsyre sonder

Summary

Ændret nukleaseaktivitet har været forbundet med forskellige menneskelige forhold, underliggende dets potentiale som en biomarkør. Den modulære og nem at implementere screeningmetode præsenteret i dette papir giver mulighed for udvælgelse af specifikke nukleinsyre sonder til at udnytte nuclease aktivitet som en biomarkør af sygdom.

Abstract

Nukleaser er en klasse af enzymer, der nedbryder nukleinsyrer ved at katalysere hydrolyse af fosfodiester bindinger, der forbinder de ribose sukkerarter. Nukleaser viser en række vitale fysiologiske roller i prokaryotiske og eukaryotiske organismer, der spænder fra at opretholde genom stabilitet til at yde beskyttelse mod patogener. Ændret nukleaseaktivitet har været forbundet med flere patologiske tilstande, herunder bakterielle infektioner og kræft. Til dette formål har nukleaseaktiviteten vist et stort potentiale for at blive udnyttet som en specifik biomarkør. En robust og reproducerbar screeningsmetode, der er baseret på denne aktivitet, er dog fortsat meget ønskelig.

Heri introducerer vi en metode, der gør det muligt at screene for nukleaseaktivitet ved hjælp af nukleinsyre sonder som substrater med omfanget af differentiering mellem patologiske og sunde tilstande. Denne metode giver mulighed for at designe nye sonde biblioteker, med stigende specificitet, på en iterativ måde. Således er flere runder af screening er nødvendige for at raffinere sonder ‘ design med forbedrede funktioner, drage fordel af tilgængeligheden af kemisk modificerede nukleinsyre syrer. Den foreslåede teknologis betydelige potentiale ligger i dens fleksibilitet, høje reproducerbarhed og alsidighed til screening af nukleaseaktiviteten i forbindelse med sygdomstilstande. Det forventes, at denne teknologi vil gøre det muligt at udvikle lovende diagnostiske værktøjer med et stort potentiale i klinikken.

Introduction

Nukleaser er en klasse af enzymer, der kan kløende fosfodiester-obligationerne, som danner rygraden i nukleinsyremolekyler. Den store mangfoldighed af nukleaser gør deres klassificering temmelig vanskelig. Der er dog nogle almindelige kriterier, der anvendes til at beskrive nukleaser, såsom substrat præference (deoxyribonukleinsyre (DNA) eller ribonukleinsyre (RNA)), spaltning site (endonukleaser eller exonucleaser), eller metal ion afhængighed, blandt andre¹. Nukleaser er stærkt bevaret katalytiske enzymer, der har fundamentale roller i både prokaryotiske og eukaryotiske organismer og er blevet brugt, og fortsat anvendes, som genredigerings værktøjer². De er også grundlæggende aktører inden for DNA-vedligeholdelse og-replikering, hvilket medvirker til at bevare genomstabiliteten og deltage i korrekturlæsning³. I bakterier, for eksempel, er nukleaser blevet identificeret som vigtige virulensfaktorer, i stand til at fremme bakteriel overlevelse ved at reducere effektiviteten af værtens immunsystem^{4,5,6,7 ,8}. I pattedyr, er nukleaser blevet foreslået at være impliceret i apoptose⁹, mitokondrie Biogenese og vedligeholdelse¹⁰ og mægling af antibakterielle og antiviral medfødte immunrespons¹¹. Ikke overraskende, nuclease aktivitet ændringer, uanset om forbedring eller mangel på, har været impliceret i en bred vifte af sygdomme hos mennesker. Disse sygdomme spænder fra en bred vifte af kræftformer^12,13 til Hjertehypertrofi¹⁰ eller autoimmune sygdomme¹⁴. Derfor er nukleaser blevet interessante kandidater som biomarkører for en uensartet gruppe af menneskelige forhold. Faktisk har nukleaser allerede vist deres potentiale som vellykkede diagnostiske værktøjer til påvisning af infektioner forårsaget af specifikke bakterielle agenser, såsom Staphylococcus aureus eller Escherichia coli^{15, 16}. i mange kræfttyper, udtryk for stafylokok nuclease domæne-holdige protein 1 (SND1) ribonuklease er tegn på dårlig prognose¹⁷. Hos patienter med kræft i bugspytkirtlen er forhøjet ribonuklease i (RNase i) serumniveauer blevet rapporteret¹⁸ og foreslået at være associeret med kræft celle fænotyper¹⁹. I iskæmiske hjertelidelser, såsom myokardieinfarkt eller ustabil angina pectoris, har deoxyribonuclease i (DNase i) serumniveauer vist sig at være en gyldig diagnostisk markør^20,21.

Det har været en hypotese, at den globale plan for nukleaseaktivitet kan være forskellige i raske og sygdomstilstande. Faktisk har nylige rapporter brugt forskelle i nukleaseaktivitet til at skelne mellem sunde og kræft fænotyper²² eller til at identificere sygdomsfremkaldende bakterielle infektioner på en artsspecifik måde^15,23. Disse fund har åbnet en ny Avenue for brugen af nukleaser som biomarkører af sygdom. Der er derfor en nødvendighed for at udvikle en omfattende screeningsmetode, der systematisk kan identificere sygdomsrelaterede forskelle i nukleaseaktiviteten, hvilket er af afgørende betydning for udviklingen af nye diagnostiske værktøjer.

Heri introducerer og beskriver vi en ny in vitro-screening tilgang (figur 1) for at identificere følsomme og specifikke sonder, der kan diskriminere mellem nukleaseaktiviteten i sund og usund, eller aktivitet, der er specifik for en type celle eller bakterier. Ved at udnytte nukleinsyrer modularitet designede vi et første bibliotek af dæmpede fluorescerende oligonukleotidsonder bestående af et omfattende sæt af forskellige sekvenser og kemi, som begge er vigtige parametre for Biblioteks design. Disse oligonukleotidsonder flankeres af en fluoroforet (fluorescein amidite, Fam) og en QUENCHER (tidevands QUENCHER 2, TQ2) ved henholdsvis 5 ‘ og 3 ‘ enderne (tabel 1). Ved at bruge denne fluorometriske analyse af energioverførsel (FRET) til måling af den enzymatiske nedbrydnings kinetik var vi i stand til at identificere kandidat sonder med potentiale til at diskriminere differentialmønstre af nukleaseaktivitet forbundet med raske eller sygdomstilstande. Vi designede en iterativ proces, hvor nye biblioteker oprettes baseret på de bedste kandidat sonder, som gør det muligt at identificere stadigt mere specifikke kandidat sonder i efterfølgende Screenings trin. Desuden udnytter denne fremgangsmåde den katalytiske karakter af nukleaser for at øge følsomheden. Dette opnås ved at drage fordel af den aktivatable karakter af reporter sonder og evne til nukleaser til kontinuerligt at behandle substrat molekyler, begge repræsenterer de vigtigste fordele i forhold til alternative antistof eller små molekyle-baserede screeningmetoder.

Denne tilgang tilbyder et yderst modulært, fleksibelt og let at gennemføre screeningsværktøj til identifikation af specifikke nukleinsyre sonder, der kan diskriminere mellem raske og sygdomstilstande, og en fremragende platform for udvikling af nye diagnostiske værktøjer, der kan tilpasses til fremtidige kliniske anvendelser. Som sådan blev denne metode anvendt til at identificere nukleaseaktiviteten afledt af salmonella typhimurium (i det følgende benævnt salmonella) til den specifikke identifikation af disse bakterier. I den følgende protokol rapporterer vi om en metode til at screene for bakteriel nukleaseaktivitet ved hjælp af kinetisk analyse.

Protocol

1. oligonukleotid bibliotek design og forberedelse Biblioteks design Baseret på følgende kriterier designe et bibliotek af standset fluorescerende oligonukleotid sonder mellem 8 og 12-Mer lang for at undgå sekundær struktur dannelse, med samme længde for alle sonder. Omfatte mindst ét DNA og en RNA-tilfældig sekvens, der indeholder en kombination af adenin (A), guanin (G), cytosin (C) og thymin (T)/uracil (U) (DNA og RNA-Proder i tabel 1).Bemærk: de DNA-og RNA-sekven…

Representative Results

Figur 1 viser arbejdsstrømmen for denne metode, som er opdelt i to screening runder. I den første runde af screening, vi brugte 5 DNA-sonder (DNA, DNA poly A, DNA poly T, DNA poly C og DNA poly G) og også 5 RNA prop’er (RNA, RNA poly A, RNA poly U RNA poly C og RNA poly G). De rå data for denne screening runde kan findes i supplerende tabel 1. I anden runde blev kemisk modificerede sonder syntetiseret ved at udskifte RNA-sekvensen med kemisk modificerede Nukleosider (all…

Discussion

Ændringer af nukleaseaktivitet har været forbundet med en bred vifte af sygdoms fænotyper, herunder forskellige typer af kræft og bakterielle infektioner. Disse ændringer foreslås at være det udløsende middel for en betingelse¹⁴, mens de i andre tilfælde er konsekvensen af en skadelig fysiologisk hændelse²⁰ eller sygdomsfremkaldende agens^16,26. Ikke overraskende, forsøg på at bruge nukleaser og nuclease …

Materials

Black bottom, non-treated 96 well plate	Fisher Scientific	10000631
Cytation1	BioTek	CYT1FAV
Eppendorf tubes	Thermofisher	11926955
Escherichia coli	ATCC	25922
Microbank cryogenic storage vial containing beads	Pro-Lab Diagnostics	22-286-155
Nucleic acid probes	Biomers.net	#
Phosphate Buffer Saline containing MgCl2 and CaCl2	Gibco™	14040117
Salmonella enterica subs. Enterica	ATCC	14028
Tris-EDTA	Fisher Scientific	10647633
Tryptone Soya Agar with defibrinated sheep blood	Thermo Fisher Scientific	10362223
Tryptic Soy Broth	Sigma Aldrich	22092