Nükleik Asit Probları Kullanılarak Nükleaz Aktivitesinin Kinetik Taraması
Summary
Değiştirilmiş nükleaz aktivitesi farklı insan koşulları ile ilişkili olmuştur, bir biyomarker olarak potansiyelinin altında yatan. Bu makalede sunulan modüler ve kolay tarama metodolojisi, hastalığın biyobelirteci olarak nükleaz aktivitesinden yararlanmak için spesifik nükleik asit problarının seçilmesine olanak sağlar.
Abstract
Nükleazlar, riboz şekerlerini birbirine bağlayan fosfodiester bağlarının hidrolizini katalize ederek nükleik asitleri parçalayan enzimler sınıfıdır. Nükleazlar prokaryotik ve ökaryotik organizmalarda genom stabilitesinin korunmasından patojenlere karşı koruma sağlamaya kadar çeşitli hayati fizyolojik roller sergilerler. Değiştirilmiş nükleaz aktivitesi bakteriyel enfeksiyonlar ve kanser de dahil olmak üzere çeşitli patolojik koşullar ile ilişkili olmuştur. Bu amaçla, nükleaz aktivitesi belirli bir biyomarker olarak istismar edilmesi için büyük bir potansiyel göstermiştir. Ancak, bu aktiviteye dayalı sağlam ve tekrarlanabilir bir tarama yöntemi son derece arzu edilir.
Burada, patolojik ve sağlıklı koşullar arasında ayrım kapsamı ile, substrat olarak nükleik asit probları kullanarak nükleaz aktivitesi için tarama sağlayan bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, yinelemeli bir şekilde, artan özgüllük ile, yeni sonda kitaplıkları tasarlama olanağı sunar. Bu nedenle, kimyasal olarak değiştirilmiş nükleik asitlerin kullanılabilirliğinden yararlanarak, probların tasarımını gelişmiş özelliklerle hassaslaştırmak için birden fazla tarama turu gereklidir. Önerilen teknolojinin önemli potansiyeli, hastalık koşullarıyla ilişkili nükleaz aktivitesinin taranması için esnekliği, yüksek tekrarlanabilirliği ve çok yönlülüğünde yatmaktadır. Bu teknolojinin klinikte büyük bir potansiyele sahip umut verici tanı araçlarının geliştirilmesine olanak sağlaması beklenmektedir.
Introduction
Nükleazlar, nükleik asit moleküllerinin omurga yapısını oluşturan fosfodiester bağlarını kırpabilen bir enzim sınıfıdır. Çekirdeklerin büyük çeşitliliği sınıflandırmalarını oldukça zorlaştırır. Ancak, substrat tercihi (deoksiribonükleik asit (DNA) veya ribonükleik asit (RNA)), dekolte alanı (ensonükleazlar veya eksikonklezler) veya metal iyon bağımlılığı gibi nükleazları tanımlamak için kullanılan bazı ortak kriterlervardır. Nükleazlar, hem prokaryotik hem de ökaryotik organizmalarda temel rolleri olan ve gen düzenleme araçları2olarak kullanılan ve kullanılmaya devam eden katalitik enzimlerdir. Onlar da DNA bakım ve çoğaltma temel aktörler, genom istikrarı tutmak için yardımcı ve prova okuma süreçlerine katılan3. Bakterilerde, örneğin, nükleazlar önemli virülans faktörleri olarak tespit edilmiştir, konak bağışıklık sisteminin etkinliğini azaltarak bakteri sağkalımını teşvik edebiliyoruz4,5,6,7 ,8. Memelilerde, nükleazlar apoptoz 9, mitokondriyalbiyogenez ve bakım10 ve antibakteriyel ve antiviral doğuştan gelen bağışıklık yanıtlarının arabuluculuk karıştığı ileri sürülmüştür11. Beklendiği gibi, nükleaz aktivitesi değişiklikleri, geliştirme veya eksikliği olsun, insan hastalıklarının geniş bir yelpazede karıştığı olmuştur. Bu hastalıklar kanserlerin geniş bir yelpazede değişir12,13 kardiyak hipertrofi10 veya otoimmün hastalıklar14. Bu nedenle, nükleazlar insan koşullarının heterojen bir grup için biyobelirteçler olarak ilginç adaylar haline gelmiştir. Aslında, nükleazlar zaten belirli bakteriyel ajanların neden olduğu enfeksiyonların tespiti için başarılı tanı araçları olarak potansiyellerini göstermiştir, Staphylococcus aureus veya Escherichia coli15gibi, 16. Birçok kanser türünde, stafilokokal nükleaz etki alanı içeren protein 1 (SND1) ribonükleaz ekspresyonu kötü prognoz un göstergesidir17. Pankreas kanseri hastalarında, yüksek ribonükleaz I (RNase I) serum düzeyleri bildirilmiştir18 ve kanserli hücrefenottipleri ile ilişkili olduğu önerilmiştir19. Iskemik kalp koşullarında, miyokard enfarktüsü veya kararsız anjina pektoris gibi, deoksiribonuklez i (DNase I) serum düzeyleri geçerli bir tanı belirteci 20 olduğu gösterilmiştir20,21.
Bu nükleaz aktivitesinin küresel planı sağlıklı ve hastalık durumlarında farklı olabilir hipotez edilmiştir. Aslında, son raporlar sağlıklı ve kanserli fenotipler22 ayırt etmek veya bir türe özgü bir şekilde patojenik bakteriyel enfeksiyonları belirlemek için nükleaz aktivitesi farklılıkları kullandık15,23. Bu bulgular, hastalığın biyobelirteçleri olarak nükleazların kullanımı için yeni bir yol açmıştır. Bu nedenle, yeni tanı araçlarının geliştirilmesinde önemli olabilecek nükleaz aktivitesindeki hastalıkla ilişkili farklılıkları sistematik olarak belirleyebilen kapsamlı bir tarama yönteminin geliştirilmesi için bir gereklilik vardır.
Burada, sağlıklı ve sağlıksız olarak nükleaz aktivitesi veya bir hücre veya bakteri türüne özgü aktivite arasında ayrım yapabilen hassas ve spesifik probları tanımlamak için yeni bir in vitro tarama yaklaşımı(Şekil 1)tanıtıyoruz ve tanımlıyoruz. Nükleik asitlerin modülerliğinden yararlanarak, kütüphane tasarımı için önemli parametreler olan, her ikisi de farklı diziler ve kimyalardan oluşan, söndürülmüş floresan oligonükleotid problardan oluşan bir başlangıç kütüphanesi tasarladık. Bu oligonükleotid problar sırasıyla 5′ ve 3′ uçlarda bir florofor (floresan amidit, FAM) ve bir sorgulayıcı (gelgit quencher 2, TQ2) ile çevrilidir (Tablo 1). Enzimatik bozulmanın kinetiğini ölçmek için bu floresan rezonans enerji transferi (FRET) bazlı florometrik testkullanarak, çekirdek aktivitesinin diferansiyel desenlerini ayırt etme potansiyeline sahip aday probları tanımlayabildik. sağlıklı veya hastalık durumları ile ilişkili. Yeni kütüphanelerin en iyi aday sondalarına dayalı olarak oluşturulduğu ve sonraki tarama adımlarında her zamankinden daha spesifik aday sondalarının belirlenmesine olanak tanıyan yinelemeli bir süreç tasarladık. Ayrıca bu yaklaşım, duyarlılığı artırmak için nükleazların katalitik yapısından yararlanır. Bu, muhabir sondaların aktivize edici doğasından ve çekirdeklerin alternatif antikor veya küçük molekül tabanlı tarama yöntemlerine göre önemli avantajları temsil eden substrat moleküllerini sürekli olarak işleme yeteneğinden yararlanarak elde edilir.
Bu yaklaşım, sağlıklı ve hastalık durumları arasında ayrım yapabilen spesifik nükleik asit problarının tanımlanması için son derece modüler, esnek ve uygulanması kolay bir tarama aracı ve yeni gelecekteki klinik uygulamalar için uyarlanabilen tanı araçları. Bu yaklaşım, salmonella Typhimurium’dan (burada Salmonellaolarak anılacaktır) bu bakterilerin spesifik olarak tanımlanması için elde edilen nükleaz aktivitesini tanımlamak için kullanılmıştır. Aşağıdaki protokolde, kinetik analiz kullanarak bakteriyel nükleaz aktivitesini taramak için bir yöntem rapor ediyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nükleaz aktivitesindeki değişiklikler, farklı kanser türleri ve bakteriyel enfeksiyonlar da dahil olmak üzere çok çeşitli hastalık fenotipleri ile ilişkilendirilmiştir. Bu değişiklikler bir durumun nedensel ajan olduğu önerilmektedir14, diğer durumlarda onlar zararlı bir fizyolojik olayın sonucu iken20 veya patojenik ajan16,26. Beklendiği gibi, bir tanıbiyomarker olarak nükleaz ve nükleaz akti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar luiza I. Hernandez (Linköping Üniversitesi) el yazması ve değerli tavsiyeler onu dikkatli revizyon için kabul etmek istiyorum. Bu çalışma, Linköping Üniversitesi’nde (Fakülte Hibe SFO-Mat-LiU No. 2009-00971) Knut ve Alice Wallenberg Vakfı ve İsveç Hükümeti Malzeme Bilimi Stratejik Araştırma Alanı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Black bottom, non-treated 96 well plate | Fisher Scientific | 10000631 | |
| Cytation1 | BioTek | CYT1FAV | |
| Eppendorf tubes | Thermofisher | 11926955 | |
| Escherichia coli | ATCC | 25922 | |
| Microbank cryogenic storage vial containing beads | Pro-Lab Diagnostics | 22-286-155 | |
| Nucleic acid probes | Biomers.net | # | |
| Phosphate Buffer Saline containing MgCl2 and CaCl2 | Gibco™ | 14040117 | |
| Salmonella enterica subs. Enterica | ATCC | 14028 | |
| Tris-EDTA | Fisher Scientific | 10647633 | |
| Tryptone Soya Agar with defibrinated sheep blood | Thermo Fisher Scientific | 10362223 | |
| Tryptic Soy Broth | Sigma Aldrich | 22092 |
References
- Yang, W. Nucleases: diversity of structure, function and mechanism. Quarterly Reviews of Biophysics. 44 (1), 1-93 (2011).
- Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communication. 9 (1), 1911 (2018).
- Mason, P. A., Cox, L. S. The role of DNA exonucleases in protecting genome stability and their impact on ageing. Age (Dordr). 34 (6), 1317-1340 (2012).
- Berends, E. T., et al. Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps. Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-586 (2010).
- Kiedrowski, M. R., et al. Staphylococcus aureus Nuc2 is a functional, surface-attached extracellular nuclease. PLoS One. 9 (4), 95574 (2014).
- Morita, C., et al. Cell wall-anchored nuclease of Streptococcus sanguinis contributes to escape from neutrophil extracellular trap-mediated bacteriocidal activity. PLoS One. 9 (8), 103125 (2014).
- Hasegawa, T., et al. Characterization of a virulence-associated and cell-wall-located DNase of Streptococcus pyogenes. Microbiology. 156, 184-190 (2010).
- Moon, A. F., et al. Structural insights into catalytic and substrate binding mechanisms of the strategic EndA nuclease from Streptococcus pneumoniae. Nucleic Acids Research. 39 (7), 2943-2953 (2011).
- Li, L. Y., Luo, X., Wang, X. Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondria. Nature. 412 (6842), 95-99 (2001).
- McDermott-Roe, C., et al. Endonuclease G is a novel determinant of cardiac hypertrophy and mitochondrial function. Nature. 478 (7367), 114-118 (2011).
- Wang, Y. T., et al. A link between adipogenesis and innate immunity: RNase-L promotes 3T3-L1 adipogenesis by destabilizing Pref-1 mRNA. Cell Death & Disease. 7 (11), 2458 (2016).
- Li, C. L., Yang, W. Z., Shi, Z., Yuan, H. S. Tudor staphylococcal nuclease is a structure-specific ribonuclease that degrades RNA at unstructured regions during microRNA decay. RNA. 24 (5), 739-748 (2018).
- Wan, L., et al. MTDH-SND1 interaction is crucial for expansion and activity of tumor-initiating cells in diverse oncogene- and carcinogen-induced mammary tumors. Cancer Cell. 26 (1), 92-105 (2014).
- Keyel, P. A. Dnases in health and disease. Developmental Biology. 429 (1), 1-11 (2017).
- Hernandez, F. J., et al. Noninvasive imaging of Staphylococcus aureus infections with a nuclease-activated probe. Nature Medicine. 20 (3), 301-306 (2014).
- Flenker, K. S., et al. Rapid Detection of Urinary Tract Infections via Bacterial Nuclease Activity. Molecular Therapy. 25 (6), 1353-1362 (2017).
- Kannan, N., Eaves, C. J. Tipping the balance: MTDH-SND1 curbs oncogene-induced apoptosis and promotes tumorigenesis. Cell Stem Cell. 15 (2), 118-120 (2014).
- Kemmer, T. P., Malfertheiner, P., Buchler, M., Kemmer, M. L., Ditschuneit, H. Serum ribonuclease activity in the diagnosis of pancreatic disease. International Journal of Pancreatology. 8 (1), 23-33 (1991).
- Fernandez-Salas, E., Peracaula, R., Frazier, M. L., de Llorens, R. Ribonucleases expressed by human pancreatic adenocarcinoma cell lines. European Journal of Biochemistry. 267 (5), 1484-1494 (2000).
- Fujibayashi, K., et al. Serum deoxyribonuclease I activity can be a useful diagnostic marker for the early diagnosis of unstable angina pectoris or non-ST-segment elevation myocardial infarction. Journal of Cardiology. 59 (3), 258-265 (2012).
- Kawai, Y., et al. Diagnostic use of serum deoxyribonuclease I activity as a novel early-phase marker in acute myocardial infarction. Circulation. 109 (20), 2398-2400 (2004).
- Hernandez, L. I., Ozalp, V. C., Hernandez, F. J. Nuclease activity as a specific biomarker for breast cancer. Chemical Communication (Cambridge). 52 (83), 12346-12349 (2016).
- Machado, I., et al. Rapid and specific detection of Salmonella infections using chemically modified nucleic acid probes. Analytica Chimica Acta. 1054, 157-166 (2019).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiment. (63), e3064 (2012).
- Worthington Biochemical Corporation. . Manual of Clinical Enzyme Measurements. , (1972).
- Burghardt, E. L., et al. Rapid, Culture-Free Detection of Staphylococcus aureus Bacteremia. PLoS One. 11 (6), 0157234 (2016).
- Bibette, J. Gaining confidence in high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (3), 649-650 (2012).
- Hernandez, L. I., Machado, I., Schafer, T., Hernandez, F. J. Aptamers overview: selection, features and applications. Current Topics in Medicinal Chemistry. 15 (12), 1066-1081 (2015).
- Pande, J., Szewczyk, M. M., Grover, A. K. Phage display: concept, innovations, applications and future. Biotechnology Advances. 28 (6), 849-858 (2010).
- Skerra, A. Alternative binding proteins: anticalins – harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities. FEBS Journal. 275 (11), 2677-2683 (2008).
- Ku, T. H., et al. Nucleic Acid Aptamers: An Emerging Tool for Biotechnology and Biomedical Sensing. Sensors (Basel). 15 (7), 16281-16313 (2015).
- Jayasena, S. D. Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics. Clinical Chemistry. 45 (9), 1628-1650 (1999).
- Gray, B. P., Brown, K. C. Combinatorial peptide libraries: mining for cell-binding peptides. Chemical Reviews. 114 (2), 1020-1081 (2014).
