Kinetische screening van Nuclease activiteit met behulp van nucleïnezuur sondes
Summary
Veranderde Nuclease activiteit is in verband gebracht met verschillende menselijke omstandigheden, die onderliggende zijn potentieel als een biomarker. De modulaire en eenvoudig te implementeren screenings methodiek die in dit document wordt gepresenteerd, maakt het mogelijk specifieke nucleïnezuur voelers te selecteren voor het benutten van Nuclease activiteit als een biomarker van de ziekte.
Abstract
Nucleasen zijn een klasse van enzymen die nucleïnezuren afbreken door de hydrolyse van de fosfodiësterbindingen die de ribose-suikers koppelen, te katalyseren. Nucleasen vertonen een verscheidenheid aan vitale fysiologische rollen in prokaryotische en eukaryote organismen, variërend van het handhaven van genoom stabiliteit tot het bieden van bescherming tegen pathogenen. Veranderde Nuclease activiteit is geassocieerd met verschillende pathologische aandoeningen, waaronder bacteriële infecties en kanker. Om dit te doen, Nuclease activiteit heeft aangetoond groot potentieel om te worden uitgebuit als een specifieke biomarker. Een robuuste en reproduceerbare screeningsmethode op basis van deze activiteit blijft echter zeer wenselijk.
Hierin introduceren we een methode die screening mogelijk maakt voor Nuclease activiteit met behulp van nucleïnezuur sondes als substraten, met de reikwijdte van het differentiëren tussen pathologische en gezonde omstandigheden. Deze methode biedt de mogelijkheid van het ontwerpen van nieuwe probe-Bibliotheken, met toenemende specificiteit, op een iteratieve manier. Zo zijn meerdere screenings rondes nodig om het ontwerp van de probes te verfijnen met verbeterde functies, waarbij gebruik wordt maken van de beschikbaarheid van chemisch gemodificeerde nucleïnezuren. Het aanzienlijke potentieel van de voorgestelde technologie ligt in de flexibiliteit, hoge reproduceerbaarheid en veelzijdigheid voor de screening van Nuclease activiteit in verband met ziekte omstandigheden. Verwacht wordt dat deze technologie de ontwikkeling van veelbelovende diagnostische hulpmiddelen mogelijk maakt met een groot potentieel in de kliniek.
Introduction
Nucleasen zijn een klasse van enzymen die in staat zijn om de fosfodiësterbindingen die de ruggengraat structuur van nucleïnezuur moleculen vormen, te cleaven. De enorme diversiteit van nucleasen maakt hun classificatie nogal moeilijk. Er zijn echter enkele gemeenschappelijke criteria die worden gebruikt om nucleasen te beschrijven, zoals substraat voorkeur (deoxyribonucleïnezuur (DNA) of ribonucleïnezuur (RNA)), decolleté (endonucleases of exonucleases), of metaalionen afhankelijkheid, onder andere1. Nucleasen zijn sterk geconjugeerde katalytische enzymen die fundamentele rollen hebben in zowel prokaryote als eukaryote organismen en zijn gebruikt, en blijven worden gebruikt, als gen editing tools2. Ze zijn ook fundamentele actoren in DNA-onderhoud en-replicatie, helpen om genoom stabiliteit te houden en deel te nemen aan proof-reading processen3. In bacteriën, bijvoorbeeld, nucleasen zijn geïdentificeerd als belangrijke virulentie factoren, in staat om bacteriële overleving te bevorderen door het verminderen van de werkzaamheid van het immuunsysteem van de gastheer4,5,6,7 ,8. Bij zoogdieren zijn nucleasen gesuggereerd om betrokken te zijn bij apoptosis9, mitochondriale biogenese en onderhoud10 en bemiddeling van antibacteriële en antivirale aangeboren immuunresponsen11. Niet verrassend, Nuclease activiteit veranderingen, of verbetering of gebrek aan, zijn betrokken bij een breed scala van menselijke ziekten. Deze ziekten variëren van een breed scala aan kankers12,13 tot cardiale hypertrofie10 of auto-immuunziekten14. Daarom zijn nucleasen interessante kandidaten geworden als biomarkers voor een heterogene groep menselijke aandoeningen. In feite hebben nucleasen al hun potentieel aangetoond als succesvolle diagnostische hulpmiddelen voor het opsporen van infecties veroorzaakt door specifieke bacteriële agentia, zoals Staphylococcus aureus of Escherichia coli15, 16. in veel soorten kanker is expressie van stafylokokken Nuclease Domain-bevattende proteïne 1 (SND1) ribonuclease indicatief voor slechte prognose17. Bij patiënten met pancreaskanker zijn verhoogde ribonuclease I (RNase I) serumspiegels gemeld18 en voorgesteld om te worden geassocieerd met kankerachtige cel fenotypes19. In ischemische hartaandoeningen, zoals myocardinfarct of instabiele angina pectoris, deoxyribonuclease i (DNase i) serumspiegels is aangetoond dat een geldige diagnostische marker20,21.
Het heeft zijn veronderstelde dat de globale blauwdruk van Nuclease activiteit kan verschillen in gezonde en ziektetoestanden. In feite hebben recente rapporten gebruik gemaakt van verschillen in Nuclease activiteit om onderscheid te maken tussen gezonde en kankerachtige fenotypes22 of om pathogene bacteriële infecties te identificeren op een soortspecifieke manier15,23. Deze bevindingen hebben een nieuwe laan geopend voor het gebruik van nucleasen als biomarkers van de ziekte. Daarom bestaat er een noodzaak voor de ontwikkeling van een uitgebreide screeningsmethode die in staat is om systematisch met de ziekte samenhangende verschillen in Nuclease activiteit te identificeren, wat van cruciaal belang kan zijn bij de ontwikkeling van nieuwe diagnostische instrumenten.
Hierin introduceren en beschrijven we een nieuwe in-vitro screening aanpak (Figuur 1) om gevoelige en specifieke sondes te identificeren die kunnen discrimineren tussen Nuclease activiteit in gezond en ongezond, of activiteit specifiek voor een type cel of bacteriën. Door gebruik te maken van de modulariteit van nucleïnezuren, ontwierpen we een initiële bibliotheek van gebluste fluorescerende oligonucleotide sondes bestaande uit een uitgebreide set van verschillende sequenties en chemici, beide zijn belangrijke parameters voor het ontwerp van de bibliotheek. Deze oligonucleotide sondes worden geflankeerd door een de (fluorescein amidite, fam) en een dorstlesser (Tide dorstlesser 2, TQ2) aan respectievelijk 5 ‘ en 3 ‘ uiteinden (tabel 1). Door gebruik te maken van deze fluorometrische assay op basis van fluorescerende resonantie energie overdracht (FRET) om de kinetiek van enzymatische afbraak te meten, konden we kandidaatsondes identificeren met het potentieel om differentiaal patronen van Nuclease activiteit te discrimineren geassocieerd met gezonde of ziektetoestanden. We ontwierpen een iteratief proces, waarin nieuwe bibliotheken worden gemaakt op basis van de beste kandidaat-sondes, die het mogelijk maakt om steeds specifiekere kandidaat-sondes te identificeren in volgende screenings stappen. Bovendien maakt deze aanpak gebruik van de katalytische aard van nucleasen om de gevoeligheid te verhogen. Dit wordt bereikt door gebruik te maken van de activeerbaar aard van de reporter sondes en het vermogen van nucleasen om substraat moleculen voortdurend te verwerken, die beide belangrijke voordelen ten opzichte van alternatieve antilichamen of kleine op moleculen gebaseerde screeningsmethoden vertegenwoordigen.
Deze aanpak biedt een zeer modulair, flexibel en eenvoudig te implementeren screening tool voor de identificatie van specifieke nucleïnezuur voelers die kunnen discrimineren tussen gezonde en ziektetoestanden, en een uitstekend platform voor de ontwikkeling van nieuwe diagnostische hulpmiddelen die kunnen worden aangepast voor toekomstige klinische toepassingen. Als zodanig werd deze benadering gebruikt om de Nuclease activiteit te identificeren die is afgeleid van salmonella typhimurium (hierna salmonellagenoemd) voor de specifieke identificatie van deze bacteriën. In het volgende Protocol rapporteren we over een methode voor het scherm voor bacteriële Nuclease-activiteit met behulp van kinetische analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Veranderingen van Nuclease activiteit zijn in verband gebracht met een breed scala aan ziekten fenotypes, met inbegrip van verschillende soorten kanker en bacteriële infecties. Deze wijzigingen worden voorgesteld als de veroorzaker van een aandoening14, terwijl in andere gevallen zij het gevolg zijn van een schadelijk fysiologisch voorval20 of pathogene agens16,26. Niet verrassend, pogingen om nucleasen en Nuclease…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Luiza I. Hernandez (Linköping University) erkennen voor haar zorgvuldige revisie van het manuscript en waardevol advies. Dit werk werd gesteund door de Stichting Knut en Alice Wallenberg en de strategische onderzoeksruimte van de Zweedse overheid in Materials Science over geavanceerde functionele materialen aan de Universiteit van Linköping (faculteits subsidie SFO-mat-LiU nr. 2009-00971).
Materials
| Black bottom, non-treated 96 well plate | Fisher Scientific | 10000631 | |
| Cytation1 | BioTek | CYT1FAV | |
| Eppendorf tubes | Thermofisher | 11926955 | |
| Escherichia coli | ATCC | 25922 | |
| Microbank cryogenic storage vial containing beads | Pro-Lab Diagnostics | 22-286-155 | |
| Nucleic acid probes | Biomers.net | # | |
| Phosphate Buffer Saline containing MgCl2 and CaCl2 | Gibco™ | 14040117 | |
| Salmonella enterica subs. Enterica | ATCC | 14028 | |
| Tris-EDTA | Fisher Scientific | 10647633 | |
| Tryptone Soya Agar with defibrinated sheep blood | Thermo Fisher Scientific | 10362223 | |
| Tryptic Soy Broth | Sigma Aldrich | 22092 |
References
- Yang, W. Nucleases: diversity of structure, function and mechanism. Quarterly Reviews of Biophysics. 44 (1), 1-93 (2011).
- Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communication. 9 (1), 1911 (2018).
- Mason, P. A., Cox, L. S. The role of DNA exonucleases in protecting genome stability and their impact on ageing. Age (Dordr). 34 (6), 1317-1340 (2012).
- Berends, E. T., et al. Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps. Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-586 (2010).
- Kiedrowski, M. R., et al. Staphylococcus aureus Nuc2 is a functional, surface-attached extracellular nuclease. PLoS One. 9 (4), 95574 (2014).
- Morita, C., et al. Cell wall-anchored nuclease of Streptococcus sanguinis contributes to escape from neutrophil extracellular trap-mediated bacteriocidal activity. PLoS One. 9 (8), 103125 (2014).
- Hasegawa, T., et al. Characterization of a virulence-associated and cell-wall-located DNase of Streptococcus pyogenes. Microbiology. 156, 184-190 (2010).
- Moon, A. F., et al. Structural insights into catalytic and substrate binding mechanisms of the strategic EndA nuclease from Streptococcus pneumoniae. Nucleic Acids Research. 39 (7), 2943-2953 (2011).
- Li, L. Y., Luo, X., Wang, X. Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondria. Nature. 412 (6842), 95-99 (2001).
- McDermott-Roe, C., et al. Endonuclease G is a novel determinant of cardiac hypertrophy and mitochondrial function. Nature. 478 (7367), 114-118 (2011).
- Wang, Y. T., et al. A link between adipogenesis and innate immunity: RNase-L promotes 3T3-L1 adipogenesis by destabilizing Pref-1 mRNA. Cell Death & Disease. 7 (11), 2458 (2016).
- Li, C. L., Yang, W. Z., Shi, Z., Yuan, H. S. Tudor staphylococcal nuclease is a structure-specific ribonuclease that degrades RNA at unstructured regions during microRNA decay. RNA. 24 (5), 739-748 (2018).
- Wan, L., et al. MTDH-SND1 interaction is crucial for expansion and activity of tumor-initiating cells in diverse oncogene- and carcinogen-induced mammary tumors. Cancer Cell. 26 (1), 92-105 (2014).
- Keyel, P. A. Dnases in health and disease. Developmental Biology. 429 (1), 1-11 (2017).
- Hernandez, F. J., et al. Noninvasive imaging of Staphylococcus aureus infections with a nuclease-activated probe. Nature Medicine. 20 (3), 301-306 (2014).
- Flenker, K. S., et al. Rapid Detection of Urinary Tract Infections via Bacterial Nuclease Activity. Molecular Therapy. 25 (6), 1353-1362 (2017).
- Kannan, N., Eaves, C. J. Tipping the balance: MTDH-SND1 curbs oncogene-induced apoptosis and promotes tumorigenesis. Cell Stem Cell. 15 (2), 118-120 (2014).
- Kemmer, T. P., Malfertheiner, P., Buchler, M., Kemmer, M. L., Ditschuneit, H. Serum ribonuclease activity in the diagnosis of pancreatic disease. International Journal of Pancreatology. 8 (1), 23-33 (1991).
- Fernandez-Salas, E., Peracaula, R., Frazier, M. L., de Llorens, R. Ribonucleases expressed by human pancreatic adenocarcinoma cell lines. European Journal of Biochemistry. 267 (5), 1484-1494 (2000).
- Fujibayashi, K., et al. Serum deoxyribonuclease I activity can be a useful diagnostic marker for the early diagnosis of unstable angina pectoris or non-ST-segment elevation myocardial infarction. Journal of Cardiology. 59 (3), 258-265 (2012).
- Kawai, Y., et al. Diagnostic use of serum deoxyribonuclease I activity as a novel early-phase marker in acute myocardial infarction. Circulation. 109 (20), 2398-2400 (2004).
- Hernandez, L. I., Ozalp, V. C., Hernandez, F. J. Nuclease activity as a specific biomarker for breast cancer. Chemical Communication (Cambridge). 52 (83), 12346-12349 (2016).
- Machado, I., et al. Rapid and specific detection of Salmonella infections using chemically modified nucleic acid probes. Analytica Chimica Acta. 1054, 157-166 (2019).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiment. (63), e3064 (2012).
- Worthington Biochemical Corporation. . Manual of Clinical Enzyme Measurements. , (1972).
- Burghardt, E. L., et al. Rapid, Culture-Free Detection of Staphylococcus aureus Bacteremia. PLoS One. 11 (6), 0157234 (2016).
- Bibette, J. Gaining confidence in high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (3), 649-650 (2012).
- Hernandez, L. I., Machado, I., Schafer, T., Hernandez, F. J. Aptamers overview: selection, features and applications. Current Topics in Medicinal Chemistry. 15 (12), 1066-1081 (2015).
- Pande, J., Szewczyk, M. M., Grover, A. K. Phage display: concept, innovations, applications and future. Biotechnology Advances. 28 (6), 849-858 (2010).
- Skerra, A. Alternative binding proteins: anticalins – harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities. FEBS Journal. 275 (11), 2677-2683 (2008).
- Ku, T. H., et al. Nucleic Acid Aptamers: An Emerging Tool for Biotechnology and Biomedical Sensing. Sensors (Basel). 15 (7), 16281-16313 (2015).
- Jayasena, S. D. Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics. Clinical Chemistry. 45 (9), 1628-1650 (1999).
- Gray, B. P., Brown, K. C. Combinatorial peptide libraries: mining for cell-binding peptides. Chemical Reviews. 114 (2), 1020-1081 (2014).
