Murine chirurgische model van actuele elastase geïnduceerde dalende thoracale aorta aneurysma
Summary
We beschrijven een chirurgisch protocol voor het consequent induceren van robuuste aflopend thoracische aorta aneurysma bij muizen. De procedure omvat linker Thoracotomie, thoracische aorta blootstelling, en plaatsing van een spons gedrenkt in varkens alvleesklier elastase op de aorta wand.
Abstract
Volgens het centrum voor ziektecontrole, aorta aneurysma (AAs) werden beschouwd als een leidende doodsoorzaak in alle rassen en beide geslachten van 1999-2016. Een aneurysma vormt een gevolg van progressieve verzwakking en uiteindelijke verwijding van de aorta, die kan scheuren of scheuren zodra het een kritische diameter bereikt. Aneurysmata van de afdalende aorta in de borst, genaamd dalende thoracale aorta aneurysmata (dtaa), vormen een groot deel van de aneurysma gevallen in de Verenigde Staten. Onopgenomen dTAA ruptuur is bijna universeel dodelijk, en electieve reparatie heeft een hoge mate van morbiditeit en sterfte. Het doel van ons model is om dTAA specifiek te bestuderen, om de pathofysiologie van dTAA te verhelseren en om moleculaire doelen te zoeken om de groei te stoppen of de grootte van dTAA te verkleinen. Door een Murine model te hebben om thoracische pathologie nauwkeurig te bestuderen, kunnen gerichte therapieën worden ontwikkeld om specifiek dTAA te testen. De methode is gebaseerd op de plaatsing van de varkens alvleesklier elastase (PPE) direct op de buitenste muriene aorta wand na chirurgische blootstelling. Dit creëert een destructieve en inflammatoire reactie, die de aorta wand verzwakt en zorgt voor aneurysma vorming gedurende weken tot maanden. Hoewel Murine-modellen beperkingen hebben, produceert ons dTAA-model robuuste aneurysmata van voorspelbare grootte. Bovendien kan dit model worden gebruikt om genetische en farmaceutische doelstellingen te testen die de groei van dTAA kunnen arresteren of ruptuur voorkomen. Bij menselijke patiënten zouden interventies zoals deze kunnen helpen voorkomen dat aneurysmaruptuur, en moeilijke chirurgische interventie.
Introduction
Het doel van deze methode is het bestuderen van de ontwikkeling, pathofysiologie, en structurele veranderingen in de Murine dalende thoracale aorta tijdens aorta aneurysma vorming. Ons model biedt een reproduceerbare en consistente methode om thoracische aorta aneurysma (dTAA) in muizen te induceren, waardoor het testen van verschillende genetische en farmacologische remmers mogelijk is. Dit werk kan helpen bij het identificeren van geneesmiddelen en gentherapieën die kunnen worden vertaald naar een levensvatbare behandelingsstrategie voor mensen met dTAA-ziekte.
dtaas vorm wanneer de wand van de thoracale aorta wordt verzwakt en verwijde na verloop van tijd tot het bereiken van een kritische diameter wanneer scheuren of ruptuur kan dan optreden. Klinisch kan dTAA in stilte vooruitgang boeken, in omvang toenemen totdat de structuur van de aorta wand zo vervormd is dat het uiteindelijk faalt, met catastrofale gevolgen. De symptomen ontwikkelen zich meestal alleen wanneer het aneurysma een gevaarlijke omvang heeft bereikt (100-150% verwijding) en een hoog risico op dissectie of ruptuur1,2. dtaa ruptuur is bijna universeel dodelijk3, en electieve chirurgische reparatie draagt significante morbiditeit4,5. Bovendien, de meeste patiënten dragen de diagnose van een aorta aneurysma voor ongeveer 5 jaar voor chirurgische reparatie6,7. Dit venster geeft een geschikt moment om niet-chirurgisch in te grijpen. Dus, medische therapieën voor de behandeling of trage progressie van dTAA zijn nodig en zou een aanzienlijke vooruitgang op het gebied van aneurysma onderzoek vertegenwoordigen. Er zijn momenteel geen medische behandelingen voor dTAA beschikbaar, vooral vanwege een onvolledig begrip van dTAA-pathogenese.
In de afgelopen 20 jaar zijn verschillende dTAA diermodellen ontwikkeld, maar elk van deze modellen waren verschillend van onze eigen en niet produceren robuuste aneurysma. Het meest vergelijkbare Murine dTAA-model is ontwikkeld door Ikonomidis et al.8, met directe toepassing van CACL2 op de adventitia van de aorta. Hoewel ons model is aangepast aan veel van de technieken die door Ikonomidis zijn uiteengezet, is ons model op drie verschillende manieren uniek. Ten eerste, in ons model de aorta wordt blootgesteld aan actuele elastase voor 3-5 minuten, in vergelijking met 15 minuten van CaCl2 blootstelling. Ten tweede, aorta dilatatie treedt op in 2 weken, in vergelijking met 16 weken in de CaCl2 model. Ten slotte produceert ons model consequent aneurysmata van ongeveer 100% dilatatie, in vergelijking met de aorta dilataties van 20-30% geproduceerd door CaCl2 -toepassing (die niet echt als aneurysmata kan worden beschouwd omdat ze worden gedefinieerd als een toename in aorta diameter > 50%). Er zijn andere niet-chirurgische Murine modellen van aneurysma vorming, zoals de APO E knock-out muis, die robuuste aneurysmata vormen met infusie van angiotensine II. Echter, deze muizen ontwikkelen supra-nier of stijgende thoracale aorta aneurysma in plaats van aneurysma specifiek in de dalende thoracale aorta9,10.
Het rationele voor dit protocol is om een eenvoudige, goedkope en tijd geschikte manier te hebben om dTAA in een muriene model te bestuderen. Het muismodel biedt een unieke kans om veel genetische en celspecifieke Knockouts te gebruiken die zijn gevonden om impactvol te zijn in andere vasculaire ziekten. Het gebruik van onze specifieke taa model is goed ontvangen en experimenten met behulp van het zijn gepubliceerd in hoge impact tijdschriften11,12. Op dit punt, het model is gebruikt voor het onderzoeken van mogelijke genetische en farmacologische behandelingen die een significant effect in de abdominale aorta aneurysma (AAA) Murine modellen had; echter, als ons lab heeft uitgebreid gebruik van de dTAA model, we zijn het vinden van doelen die uniek zijn voor dTAA formatie die kan worden gebruikt als gerichte therapieën bij de mens.
Dit model is het meest geschikt voor laboratoria die Murine micro-chirurgische capaciteiten hebben. Hoewel het technisch uitdagend, het kan worden uitgevoerd consequent zelfs door onderzoekers zonder voorafgaande chirurgische ervaring. Voor een onderzoeker zonder muriene chirurgische ervaring kan het model worden beheerst in ongeveer 20 operatieve sessies (of ongeveer 50 muizen). Voor de onderzoeker met voorafgaande chirurgische ervaring, het model kan worden beheerst in 5 operatieve sessies (ongeveer 20 muizen). We geloven met een video van hoge kwaliteit, de tijd tot meesterschap kan verder worden gereduceerd. Nadat de vaardigheid is bereikt, kan de procedure worden voltooid in 35 minuten voor de operatie, en 20 minuten voor de Terminal oogst. De chirurgen in ons laboratorium kunnen 10-12 volledige operaties per dag voltooien, met een operatieve sterfte graad van 5-10%. De meest voorkomende oorzaak van sterfte is long letsel bij binnenkomst op de borst, verdoving toxiciteit, of scheur van de aorta tijdens dissectie. Naast dTAA-onderzoek dient dit model ook als een leidraad voor veilige en gemakkelijke toegang tot de thoracale aorta en Lung Hilum voor onderzoekers die andere interventies in de borstkas bestuderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De thoracale en abdominale aorta zijn cellullair en embryologisch verschillend, wat relevant is voor aneurysmaal ziekte14,15,16. Daarom is een specifiek diermodel nodig om TAA te bestuderen. Hoewel andere Murine dTAA modellen zijn gepubliceerd8, onze is het enige model om dalende thoracale aorta dilatatie die kan worden beschouwd als echt aneurysmatische (meer dan 50% verwijding). Bovendien, ons model is …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door AHA Scientist Development Grant 14SDG18730000 (M.S.), NIH K08 HL098560 (G.A.) en RO1 HL081629 (G.R.U.) subsidies. Dit project werd gesteund door de thoracic surgery Foundation for Research & Education (TSFRE) Research Grant (PI: G. Ailawadi). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de standpunten van de NHLBI of de TSFRE. We bedanken Anthony Herring en Cindy Dodson voor hun kennis en technische expertise.
Materials
| Angiocatheter (22G) | Used for ET Tube | ||
| Dumont Tweezers; Pattern #7 x2 | Roboz | RS-4982 | |
| Graefe Tissue Forceps | Roboz | RS-5158 | |
| Harms Forceps x2 | Roboz | RS-5097 | |
| Intracardiac Needle Holder; Extra Delicate; Carbide Jaws; 7" Length | Roboz | RS-7800 | |
| KL 1500 LED Light Source | Leica | 150-400 | |
| M205A Dissction Microscope | Leica | CH 94-35 | |
| Iris Scissors, 11cm, Tungsten Carbide | World Precision Instruments | 500216-G | |
| Metal Clip board | Use with the Mouse Retractor Set | ||
| Mouse Retractor Set | Kent | SURGI-5001 | Need 2 short and 1 tall fixators |
| Mouse Ventilator MiniVent Type 845, 115 V, Power Supply with US Connector | Harvard Apparatus | 73-0043 | MiniVent Ventilator for Mice (Model 845), Single Animal, Volume Controlled |
| Sigma Aldrich | Elastase from porcine pancreas | E0258-50MG | Can be purchased in various size bottles |
| Small Vessel Cauterizer Kit | Fine Science Tools | 18000-00 | Recommend using rechargable AA batteries |
| Spring Scissors, 10.5cm | World Precision Instruments | 14127 | |
| Steril Swabs (Sponges) | Sugi | 31603 | Can be cut to size |
| Surgi Suite Surgical Platform | Kent | Attach to clip board | |
| Tech IV Isoflurane Vap | Jorgensen Laboratories | J0561A | Anesthesia vaporizer |
References
- Coady, M. A., et al. What is the appropriate size criterion for resection of thoracic aortic aneurysms. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 113 (3), 489-491 (1997).
- Aggarwal, S., Qamar, A., Sharma, V., Sharma, A. Abdominal aortic aneurysm: A comprehensive review. Experimental and Clinical Cardiology. 16 (1), 11-15 (2011).
- Bickerstaff, L. K., et al. Thoracic aortic aneurysms: a population-based study. Surgery. 92 (6), 1103-1108 (1982).
- Cheng, D., et al. Endovascular aortic repair versus open surgical repair for descending thoracic aortic disease a systematic review and meta-analysis of comparative studies. Journal of the American College of Cardiology. 55 (10), 986-1001 (2010).
- Walsh, S. R., et al. Endovascular stenting versus open surgery for thoracic aortic disease: systematic review and meta-analysis of perioperative results. Journal of Vascular Surgery. 47 (5), 1094-1098 (2008).
- Absi, T. S., et al. Altered patterns of gene expression distinguishing ascending aortic aneurysms from abdominal aortic aneurysms: complementary DNA expression profiling in the molecular characterization of aortic disease. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 126 (2), 344-357 (2003).
- Ailawadi, G., Eliason, J. L., Upchurch, G. R. Current concepts in the pathogenesis of abdominal aortic aneurysm. Journal of Vascular Surgery. 38 (3), 584-588 (2003).
- Ikonomidis, J. S., et al. A murine model of thoracic aortic aneurysms. Journal of Surgical Research. 115 (1), 157-163 (2003).
- Daugherty, A., Manning, M. W., Cassis, L. A. Angiotensin II promotes atherosclerotic lesions and aneurysms in apolipoprotein E-deficient mice. Journal of Clinical Investigation. 105 (11), 1605-1612 (2000).
- Trachet, B., et al. Ascending Aortic Aneurysm in Angiotensin II-Infused Mice: Formation, Progression, and the Role of Focal Dissections. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (4), 673-681 (2016).
- Johnston, W. F., et al. Inhibition of interleukin-1beta decreases aneurysm formation and progression in a novel model of thoracic aortic aneurysms. Circulation. 130 (11), 51-59 (2014).
- Pope, N. H., et al. Interleukin-6 Receptor Inhibition Prevents Descending Thoracic Aortic Aneurysm Formation. Annals of Thoracic Surgery. 100 (5), 1620-1626 (2015).
- Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).
- Ailawadi, G., et al. A nonintrinsic regional basis for increased infrarenal aortic MMP-9 expression and activity. Journal of Vascular Surgery. 37 (5), 1059-1066 (2003).
- Ruddy, J. M., Jones, J. A., Spinale, F. G., Ikonomidis, J. S. Regional heterogeneity within the aorta: relevance to aneurysm disease. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 136 (5), 1123-1130 (2008).
- Trigueros-Motos, L., et al. Embryological-origin-dependent differences in homeobox expression in adult aorta: role in regional phenotypic variability and regulation of NF-kappaB activity. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (6), 1248-1256 (2013).
- Lu, G. S. G., Davis, J. P., Schaheen, B., Downs, E., Roy, R. J., Ailawadi, G., Upchurch, G. R. A novel chronic advanced staged abdominal aortic aneurysm murine model. Journal of Vascular Surgery. 66 (1), 232-242 (2017).
