JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

في تقييم فيفو الضامة السنخيه افيروسيتوسيس بعد التعرض للأوزون

Published: October 22, 2019
doi:
10.3791/60109
, , ,
1Department of Pharmacology and Toxicology,East Carolina University, 2Research Triangle Park,National Institute of Environmental Health and Sciences

Summary

تصف هذه المخطوطة بروتوكولا لتحديد ما إذا كان التعرض للأوزون ، وهو معيار من ملوثات الهواء ، يضعف الضامة السنخيه الافيروسيتوسيسه في الجسم المجري. يستخدم هذا البروتوكول الكواشف والتقنيات المستخدمة بشكل شائع ويمكن تكييفها مع نماذج متعددة من الإصابات الرئوية لتحديد الآثار علي افيروسيتوسيس الضامة السنخيه.

Abstract

الأوزون (O3) هو معيار ملوث الهواء الذي يفاقم ويزيد من حدوث الامراض الرئوية المزمنة. ومن المعروف O3 التعرض للحث علي التهاب رئوي ، ولكن يعرف القليل بشان كيفيه التعرض يغير العمليات الهامه لحل التهاب. افيروسيتوسيس هو عمليه القرار ، حيث الضامة الخلايا ابوتوتيك. الغرض من هذا البروتوكول هو قياس الضامة السنخيه افيروسيتوسيس بعد O3-الناجمة عن أصابه الرئة والتهاب. وقد وصفت عده طرق لقياس الافيروسيتوسيس ؛ ومع ذلك ، معظم تتطلب التلاعب السابقين الجسم الآخر. وصفت بالتفصيل هنا هو بروتوكول لقياس في الجسم الضام السنخيه افيروسيتوسيس 24 ح بعد O3 التعرض ، الذي يتجنب التلاعب الجسم السابق من الضامة وبمثابه تقنيه بسيطه التي يمكن استخدامها لتمثيل بدقه الاضطرابات في عمليه الحل هذه. البروتوكول هو طريقه غير مكثفه من الناحية الفنية وغير مكلفه نسبيا التي تنطوي علي الجسم كله O3 استنشاق متبوعا بلعوم الطموح من الخلايا ابوتوتيك (اي خلايا T jurkat) بينما تحت التخدير العام. ثم يقاس افيروسيتوسيس الضامة السنخيه بتقييم المجهري الخفيفة من الضامة التي تم جمعها من غسل البرونزية (BAL). يتم قياس افيروسيتوسيس أخيرا عن طريق حساب مؤشر افيروسيتيك. وبشكل جماعي ، فان الطرق المبينة تحدد النشاط افيروسيتيك في الرئة في الجسم المجري بينما تعمل أيضا علي تحليل الآثار الصحية السلبية لل O3 أو الشتائم المستنشقة الأخرى.

Introduction

تتعرض الرئة باستمرار إلى الإهانات البيئية ، بما في ذلك الجسيمات الهوائية ، والفيروسات ، والبكتيريا ، والغازات المؤكسدة التي تؤدي إلى التهاب رئوي1،2،3. هذه الإهانات يمكن ان تضر تبادل الغاز والحثعلي أصابه الانسجه لا رجعه فيه 4,5. الضامة السنخيه ، التي تشكل حوالي 95 ٪ من الخلايا المناعية الموجودة في murine والرئتين البشرية في التوازن ، هي المنظمين الحرجة من التهاب رئوي بعد الإهانات البيئية1،2، 3،4،5. الضامة السنخيه ضرورية خلال الدفاع المضيف عن طريق التخدير والقضاء علي مسببات الامراض. في الاونه الاخيره ، وقد ثبت الضامة السنخيه لتعزيز التوازن الانسجه وحل التهاب من خلال افيروسيتوسيس6،7. افيروسيتوسيس هو عمليه الفاجريه التي تبتلع الضامة والقضاء علي خلايا ابوتوتيك8،9،10. افيروسيتوسيس أيضا نتائج في إنتاج وسطاء (اي ، آيل-10 ، tgf-β ، pge2، وأكسيد النيتريك) التي تزيد من زيادة العملية ، مما ادي إلى حل التهابات9،10،11 و12و16و18. هذه العملية ضرورية لمنع النخر الثانوي وتعزيز التوازن الانسجه12,13,14. وقد ربطت العديد من الدراسات ضعف الافيروسيتوسيس مع مختلف امراض الرئة المزمنة, بما في ذلك الربو, مرض الانسداد الرئوي المزمن, والتليف الرئوي مجهول العلة8,9,15, 16و17.

O3 هو معيار الملوثات الجوية التي تفاقم ويزيد من الاصابه بامراض الرئة المزمنة19،20،21. O3 يستحث التهاب الرئة والاصابه ، ومن المعروف ان يضعف الضامة السنخيه من مسببات الامراض البكتيرية22،23. ومع ذلك ، فمن غير المعروف ما إذا كان O3 يضعف الضامة السنخيه افيروسيتوسيس. التحقيق O3-التي يسببها التعديلات في افيروسيتوسيس الضامة السنخيه سوف توفر البصيرة المحتملة في كيفيه التعرض يمكن ان يؤدي إلى حدوث امراض الرئة المزمنة وتفاقم. ويرد أدناه طريقه بسيطه لتقييم الضامة السنخيه افيروسيتوسيس في رئتي الفئران الإناث بعد التعرض الحاد O3 .

الأسلوب المبينة posseses العديد من المزايا علي بروتوكولات افيروسيتوسيس الأخرى التي يشيع استخدامها في الميدان عن طريق القضاء علي استخدام الاصباغ الفلورية مكلفه, قياسات تدفق واسعه النطاق الخلوي, والتلاعب السابقة الجسم الضام من السنخيه24 ،25. بالاضافه إلى ذلك ، يقيس هذا البروتوكول افيروسيتوسيس الضامة السنخيه في سياق البيئة المجهرية الرئة ، والتي يمكن ان تؤثر علي وظيفة الضامة.

Protocol

وقد تمت الموافقة علي جميع الأساليب من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانية (IACUC) من جامعه ولاية كارولينا الشرقية. 1-الأوزون (O3) والتعرض للهواء المصفي (اليوم الأول) وضع حد اقصي 12 الإناث C57BL/6J الفئران ، 8-12 أسابيع من العمر ، في قفص من الصلب (مع 12 مقصورات منفصلة) …

Representative Results

O3 التعرض هو معروف للحث علي التهاب الرئة والاصابه ، ومطلوب افيروسيتوسيس للحفاظ علي التوازن الانسجه. C57BL/6J الفئران الإناث تعرضت لتصفيه الهواء (FA) أو 1 جزء في المليون O3 لمده 3 ساعات والانحلال 24 ساعة بعد التعرض لفحص التهاب الرئة والاصابه. O أظهرت الفئران3المكش?…

Discussion

افيروسيتوسيس هو عمليه مضاده للالتهابات التي الضامة واضحة خلايا ابوتوتيك والحطام ، فضلا عن إنتاج متعددة الوسطاء المضادة للالتهابات9،10،11،12،16 ،18. وقد قدمت نماذج متعددة من افيروسيت?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يتم تمويل هذه الدراسة من قبل معهد الآثار الصحية والتر ا. روزنبليث جائزه و NIEHS R01ES028829 (إلى k. m. G). ونود ان نشكر الدكتورة ديان والترز (قسم فسيولوجيا ، ECU) لمساعدتها في الحصول علي صور تمثيليه من الضامة السنخيه.

Materials

Annexin V-FITC Kit Trevigen 4830-250-K  The TACS Annexin V-FITC Kit allows rapid, specific, and quantitative identification of apoptosis in individual cells when using flow cytometry.
BCL2 Jurkat T Cells  ATCC ATCC CRL-2899 The BCL2 Jurkat cell line was derived by transfecting human Jurkat T cells with the pSFFV-neo mammalian expression vector containing the human BCL-2 ORF insert and a neomycin-resistant gene. Has been for models of measuring efferocytosis. 
Countess II Automated Cell Counter Thermofisher AMQAX1000 It is a benchtop assay platform equipped with state-of-the-art optics, full autofocus, and image analysis software for rapid assessment of cells in suspension. Very easy to use.
Cytospin 4 Cytocentrifuge Thermofisher A78300003 Provides economical thin-layer preparations from any liquid matrix, especially hypocellular fluids such as bronchoalveolar lavage fluid.
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated Thermofisher 16140071 Provides Nutrients to cultured cells for them to grow. It is standard for cell culture. 
Kwik-Diff  Reagent 2, Eosin Thermofisher 9990706 Eosin staining that stains cytoplasm.
Kwik-Diff Reagent 1, Fixative Thermofisher 9990705 Fixes cells to be stained by H&E.
Kwik-Diff Reagent 3, Methylene Blue Thermofisher 9990707 Methylene Blue staining that stains the nucleus.
Penicillin-Streptomycin Sigma/Aldrich P0781-100ML Penicillin-Streptomycin is the most commonly used antibiotic solution for culture of mammalian cells. Additionally it is used to maintain sterile conditions during cell culture.
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement  Thermofisher 61870036 RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) was originally developed to culture human leukemic cells in suspension and as a monolayer. RPMI 1640 medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells, including HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrocytes, and carcinomas. Helps grow Jurkat T cells fast and efficiently.
Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Crosslinker Cambridge Scientific  16659 The Stratalinker UV crosslinker is designed to induce apoptosis, crosslink DNA or RNA to nylon, nitrocellulose, or nylon-reinforced nitrocellulose membranes.
Teledyne T400 ultraviolet light photometer  Teledyne API T400 The Model T400 UV Absorption analyzer uses a system based on the Beer-Lambert law for measuring low ranges of ozone in ambient air.
Teledyne T703 Ozone calibrator Teledyne API T703 Provides feedback control of the UV lamp intensity, assuring stable ozone output.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Puttur, F., Gregory, L. G., Lloyd, C. M. Airway macrophages as the guardians of tissue repair in the lung. Immunology and Cell Biology. , (2019).
  2. Gregoire, M., et al. Impaired efferocytosis and neutrophil extracellular trap clearance by macrophages in ARDS. European Respiratory Journal. 52 (2), (2018).
  3. Fan, E. K. Y., Fan, J. Regulation of alveolar macrophage death in acute lung inflammation. Respiratory Research. 19 (1), 50 (2018).
  4. Michlewska, S., McColl, A., Rossi, A. G., Megson, I. L., Dransfield, I. Clearance of dying cells and autoimmunity. Autoimmunity. 40 (4), 267-273 (2007).
  5. Bhattacharya, J., Westphalen, K. Macrophage-epithelial interactions in pulmonary alveoli. Seminars in Immunopathology. 38 (4), 461-469 (2016).
  6. Donnelly, L. E., Barnes, P. J. Defective phagocytosis in airways disease. Chest. 141 (4), 1055-1062 (2012).
  7. Morimoto, K., Janssen, W. J., Terada, M. Defective efferocytosis by alveolar macrophages in IPF patients. Respiratory Medicine. 106 (12), 1800-1803 (2012).
  8. Vandivier, R. W., et al. Dysfunctional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibits phagocytosis of apoptotic cells with proinflammatory consequences. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 297 (4), L677-L686 (2009).
  9. Grabiec, A. M., et al. Diminished airway macrophage expression of the Axl receptor tyrosine kinase is associated with defective efferocytosis in asthma. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 1144-1146 (2017).
  10. Chen, W., Frank, M. E., Jin, W., Wahl, S. M. TGF-beta released by apoptotic T cells contributes to an immunosuppressive milieu. Immunity. 14 (6), 715-725 (2001).
  11. Gao, Y., Herndon, J. M., Zhang, H., Griffith, T. S., Ferguson, T. A. Antiinflammatory effects of CD95 ligand (FasL)-induced apoptosis. Journal of Experimental Medicine. 188 (5), 887-896 (1998).
  12. O’Brien, B. A., Fieldus, W. E., Field, C. J., Finegood, D. T. Clearance of apoptotic beta-cells is reduced in neonatal autoimmune diabetes-prone rats. Cell Death and Differentiation. 9 (4), 457-464 (2002).
  13. Shen, Z. X., et al. Mineralocorticoid Receptor Deficiency in Macrophages Inhibits Atherosclerosis by Affecting Foam Cell Formation and Efferocytosis. Journal of Biological Chemistry. 292 (3), 925-935 (2017).
  14. Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection. Frontiers in Immunology. 9, 1777 (2018).
  15. Hamon, R., et al. Bushfire smoke is pro-inflammatory and suppresses macrophage phagocytic function. Science Reports. 8 (1), 13424 (2018).
  16. Angsana, J., Chen, J., Liu, L., Haller, C. A., Chaikof, E. L. Efferocytosis as a regulator of macrophage chemokine receptor expression and polarization. European Journal of Immunology. 46 (7), 1592-1599 (2016).
  17. Karaji, N., Sattentau, Q. J. Efferocytosis of Pathogen-Infected Cells. Frontiers in Immunology. 8, 1863 (2017).
  18. Brouckaert, G., et al. Phagocytosis of necrotic cells by macrophages is phosphatidylserine dependent and does not induce inflammatory cytokine production. Molecular Biology of the Cell. 15 (3), 1089-1100 (2004).
  19. Gonzalez-Guevara, E., et al. Exposure to ozone induces a systemic inflammatory response: possible source of the neurological alterations induced by this gas. Inhalation Toxicology. 26 (8), 485-491 (2014).
  20. Robertson, S., et al. CD36 mediates endothelial dysfunction downstream of circulating factors induced by O3 exposure. Toxicological Sciences. 134 (2), 304-311 (2013).
  21. Kilburg-Basnyat, B., et al. Specialized Pro-Resolving Lipid Mediators Regulate Ozone-Induced Pulmonary and Systemic Inflammation. Toxicological Sciences. 163 (2), 466-477 (2018).
  22. Jakab, G. J., Spannhake, E. W., Canning, B. J., Kleeberger, S. R., Gilmour, M. I. The effects of ozone on immune function. Environ Health Perspect. 103 Suppl 2, 77-89 (1995).
  23. Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone. Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).
  24. Nayak, D. K., Mendez, O., Bowen, S., Mohanakumar, T. Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages. Journal of Visualized Experiments. 10 (134), (2018).
  25. Tao, H., et al. Macrophage SR-BI mediates efferocytosis via Src/PI3K/Rac1 signaling and reduces atherosclerotic lesion necrosis. Journal of Lipid Research. 56 (8), 1449-1460 (2015).
  26. Coe, L. M., et al. FGF-23 is a negative regulator of prenatal and postnatal erythropoiesis. Journal of Biological Chemistry. 289 (14), 9795-9810 (2014).
  27. Yong, W. K., Abd Malek, S. N. Xanthohumol induces growth inhibition and apoptosis in ca ski human cervical cancer cells. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. , 921306 (2015).
  28. Van de Laar, L., et al. Yolk Sac Macrophages, Fetal Liver, and Adult Monocytes Can Colonize an Empty Niche and Develop into Functional Tissue-Resident Macrophages. Immunity. 44 (4), 755-768 (2016).
  29. Lavin, Y., et al. Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment. Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).
  30. Beattie, L., et al. Bone marrow-derived and resident liver macrophages display unique transcriptomic signatures but similar biological functions. Journal of Hepatology. 65 (4), 758-768 (2016).
  31. Svedberg, F. R., et al. The lung environment controls alveolar macrophage metabolism and responsiveness in type 2 inflammation. Nature Immunology. , (2019).
  32. Crowther, J. E., et al. Pulmonary surfactant protein a inhibits macrophage reactive oxygen intermediate production in response to stimuli by reducing NADPH oxidase activity. Journal of Immunology. 172 (11), 6866-6874 (2004).
  33. Silveyra, P., Floros, J. Genetic variant associations of human SP-A and SP-D with acute and chronic lung injury. Frontiers in Bioscience. 17, 407-429 (2012).
  34. Schagat, T. L., Wofford, J. A., Wright, J. R. Surfactant protein A enhances alveolar macrophage phagocytosis of apoptotic neutrophils. Journal of Immunology. 166 (4), 2727-2733 (2001).
  35. Gomez Perdiguero, E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
  36. Nebbioso, A., et al. Time-resolved analysis of DNA-protein interactions in living cells by UV laser pulses. Scientific Reports. 7 (1), 11725 (2017).
  37. Novak, Z., et al. Efficacy of different UV-emitting light sources in the induction of T-cell apoptosis. Photochemistry and Photobiology. 79 (5), 434-439 (2004).
  38. Park, Y. J., et al. PAI-1 inhibits neutrophil efferocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (33), 11784-11789 (2008).
  39. Kleeberger, S. R., Reddy, S., Zhang, L. Y., Jedlicka, A. E. Genetic susceptibility to ozone-induced lung hyperpermeability: role of toll-like receptor 4. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 22 (5), 620-627 (2000).
  40. Wesselkamper, S. C., Chen, L. C., Kleeberger, S. R., Gordon, T. Genetic variability in the development of pulmonary tolerance to inhaled pollutants in inbred mice. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 281 (5), L1200-L1209 (2001).

Tags

Keywords: Alveolar MacrophageEfferocytosisOzone ExposureLung InjuryInflammationJurkat T CellsApoptotic CellsUV IrradiationCell CultureIn Vivo Assessment
check_url/60109?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Hodge, M. X., Reece, S. W., Madenspacher, J. H., Gowdy, K. M. In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure. J. Vis. Exp. (152), e60109, doi:10.3791/60109 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image