В Vivo Оценка Альвеолярного макрофажа Эффероцитоз после воздействия озона
Summary
Данная рукопись описывает протокол для определения того, является ли воздействие озона, критерия загрязнителя воздуха, ухудшает альвеолярный макрофаг энеррозитоз in vivo. Этот протокол использует широко используемые реагенты и методы и может быть адаптирован к нескольким моделям легочной травмы, чтобы определить влияние на альвеолярный макрофage эпрероцитоз.
Abstract
Озон (O3) является критерием загрязнителя воздуха, который усугубляет и увеличивает заболеваемость хроническими легочными заболеваниями. O3 воздействия, как известно, вызывают воспаление легких, но мало известно о том, как воздействие изменяет процессы, важные для разрешения воспаления. Эффероцитоз является процесс разрешения, в котором макрофаги фагоцитации апоптотические клетки. Цель юга этого протокола состоит в том, чтобы измерить альвеолярный макрофаг эпрероцитоз после O3индуцированной травмы легких и воспаления. Было описано несколько методов измерения эффоцитоза; однако, большинство из них требуют манипуляций ex vivo. Описано в деталях здесь протокол для измерения в vivo альвеолярный макрофage efferocytosis 24 ч после O3 воздействия, который избегает ex vivo манипуляции макрофагов и служит простой метод, который может быть использован для точного представления возмущений в этот процесс разрешения. Протокол является технически неинтенсивным и относительно недорогим методом, который включает в себя ингаляцию всего тела O3 с последующим аспириальным аспирированием апоптотических клеток (т.е. юркат Т-клеток) в то время как под общим наркозом. Альвеолярный макрофage efferocytosis затем измеряется световой микроскопии оценки макрофагов, собранных из бронхоальвеолярной (BAL) лаважа. Эффероцитоз, наконец, измеряется путем расчета энемероцитарного индекса. В совокупности, изложенные методы количественно эвэроцитической активности в легких in vivo, а также выступающей для анализа негативных последствий для здоровья O3 или других ингаляционных оскорблений.
Introduction
Легкое постоянно подвергается воздействию экологических оскорблений, в том числе частиц воздуха, вирусов, бактерий и окислительных газов, которые вызывают воспаление легких1,2,3. Эти оскорбления могут поставить под угрозу газообмен и вызвать необратимые повреждения тканей4,5. Альвеолярные макрофаги, которые составляют примерно 95% иммунных клеток, найденных в мурин и легких человека при гомеостазах, являются критическими регуляторами воспаления легких после экологических оскорблений1,2, 3,4,5. Альвеолярные макрофаги имеют важное значение во время защиты хозяина путем фагоцитизации и устранения патогенных микроорганизмов. В последнее время альвеолярные макрофаги были показаны для содействия ткани гомеостаза и разрешения воспаления через эффоцитоз6,7. Эффроцитоз является фагоцитарный процесс, в котором макрофаги поглотить и устранить апоптотические клетки8,9,10. Эфтероцитоз также приводит к производству посредников (т.е., IL-10, TGF-я, PGE2, и оксида азота), что еще больше увеличить процесс, в результате чего разрешение воспаления9,10,11 ,12,16,18. Этот процесс необходим для профилактики вторичного некроза и содействия ткани гомеостаза12,13,14. Несколько исследований связали нарушения эвнерозитоза с различными хроническими заболеваниями легких, включая астму, хроническую обструктивную болезнь легких, и идиопатический легочный фиброз8,9,15, 16,17.
O3 является критерием загрязнителя воздуха, который усугубляет и увеличивает заболеваемость хроническими легочными заболеваниями19,20,21. O3 вызывает воспаление легких и травмы и, как известно, ухудшить альвеолярный макрофаг фагоцитоз бактериальных патогенов22,23. Тем не менее, неизвестно, является ли O3 ухудшает альвеолярный макрофаг энероцитоза. ИсследованиеO 3-индуцированных изменений в альвеолярных макрофаг эпрероцитоз даст потенциальное представление о том, как воздействие может привести к хронической заболеваемости легочнымзаболеванием и обострение. Ниже описан простой метод оценки альвеолярного макрофага эффоцитоза в легких самок мышей после острого воздействия O3.
Изложенный метод обладает рядом преимуществ по сравнению с другими протоколами эневоцитоза, обычно используемыми в этой области, устраняя использование дорогостоящих флуоресцентных красителей, обширные измерения цитометрии потока и манипуляции ex vivo альвеолярных макрофагов24 ,25. Кроме того, этот протокол измеряет альвеолярный макрофаг энероцитоз в контексте микроокружения легких, который может влиять на функцию макрофагов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эффероцитоз является противовоспалительным процессом, в котором макрофаги очистить апоптотические клетки и мусор, а также производить несколько противовоспалительных посредников9,10,11,12,16 ,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование финансируется Институтом воздействия на здоровье Уолтера А. Розенблита премии и NIEHS R01ES028829 (к K. M. G). Мы хотели бы поблагодарить д-р Дайан Уолтерс (Департамент физиологии, ECU) за ее помощь в получении репрезентативных изображений альвеолярных макрофагов.
Materials
| Annexin V-FITC Kit | Trevigen | 4830-250-K | The TACS Annexin V-FITC Kit allows rapid, specific, and quantitative identification of apoptosis in individual cells when using flow cytometry. |
| BCL2 Jurkat T Cells | ATCC | ATCC CRL-2899 | The BCL2 Jurkat cell line was derived by transfecting human Jurkat T cells with the pSFFV-neo mammalian expression vector containing the human BCL-2 ORF insert and a neomycin-resistant gene. Has been for models of measuring efferocytosis. |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermofisher | AMQAX1000 | It is a benchtop assay platform equipped with state-of-the-art optics, full autofocus, and image analysis software for rapid assessment of cells in suspension. Very easy to use. |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermofisher | A78300003 | Provides economical thin-layer preparations from any liquid matrix, especially hypocellular fluids such as bronchoalveolar lavage fluid. |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Thermofisher | 16140071 | Provides Nutrients to cultured cells for them to grow. It is standard for cell culture. |
| Kwik-Diff Reagent 2, Eosin | Thermofisher | 9990706 | Eosin staining that stains cytoplasm. |
| Kwik-Diff Reagent 1, Fixative | Thermofisher | 9990705 | Fixes cells to be stained by H&E. |
| Kwik-Diff Reagent 3, Methylene Blue | Thermofisher | 9990707 | Methylene Blue staining that stains the nucleus. |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma/Aldrich | P0781-100ML | Penicillin-Streptomycin is the most commonly used antibiotic solution for culture of mammalian cells. Additionally it is used to maintain sterile conditions during cell culture. |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 61870036 | RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) was originally developed to culture human leukemic cells in suspension and as a monolayer. RPMI 1640 medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells, including HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrocytes, and carcinomas. Helps grow Jurkat T cells fast and efficiently. |
| Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Crosslinker | Cambridge Scientific | 16659 | The Stratalinker UV crosslinker is designed to induce apoptosis, crosslink DNA or RNA to nylon, nitrocellulose, or nylon-reinforced nitrocellulose membranes. |
| Teledyne T400 ultraviolet light photometer | Teledyne API | T400 | The Model T400 UV Absorption analyzer uses a system based on the Beer-Lambert law for measuring low ranges of ozone in ambient air. |
| Teledyne T703 Ozone calibrator | Teledyne API | T703 | Provides feedback control of the UV lamp intensity, assuring stable ozone output. |
References
- Puttur, F., Gregory, L. G., Lloyd, C. M. Airway macrophages as the guardians of tissue repair in the lung. Immunology and Cell Biology. , (2019).
- Gregoire, M., et al. Impaired efferocytosis and neutrophil extracellular trap clearance by macrophages in ARDS. European Respiratory Journal. 52 (2), (2018).
- Fan, E. K. Y., Fan, J. Regulation of alveolar macrophage death in acute lung inflammation. Respiratory Research. 19 (1), 50 (2018).
- Michlewska, S., McColl, A., Rossi, A. G., Megson, I. L., Dransfield, I. Clearance of dying cells and autoimmunity. Autoimmunity. 40 (4), 267-273 (2007).
- Bhattacharya, J., Westphalen, K. Macrophage-epithelial interactions in pulmonary alveoli. Seminars in Immunopathology. 38 (4), 461-469 (2016).
- Donnelly, L. E., Barnes, P. J. Defective phagocytosis in airways disease. Chest. 141 (4), 1055-1062 (2012).
- Morimoto, K., Janssen, W. J., Terada, M. Defective efferocytosis by alveolar macrophages in IPF patients. Respiratory Medicine. 106 (12), 1800-1803 (2012).
- Vandivier, R. W., et al. Dysfunctional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibits phagocytosis of apoptotic cells with proinflammatory consequences. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 297 (4), L677-L686 (2009).
- Grabiec, A. M., et al. Diminished airway macrophage expression of the Axl receptor tyrosine kinase is associated with defective efferocytosis in asthma. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 1144-1146 (2017).
- Chen, W., Frank, M. E., Jin, W., Wahl, S. M. TGF-beta released by apoptotic T cells contributes to an immunosuppressive milieu. Immunity. 14 (6), 715-725 (2001).
- Gao, Y., Herndon, J. M., Zhang, H., Griffith, T. S., Ferguson, T. A. Antiinflammatory effects of CD95 ligand (FasL)-induced apoptosis. Journal of Experimental Medicine. 188 (5), 887-896 (1998).
- O’Brien, B. A., Fieldus, W. E., Field, C. J., Finegood, D. T. Clearance of apoptotic beta-cells is reduced in neonatal autoimmune diabetes-prone rats. Cell Death and Differentiation. 9 (4), 457-464 (2002).
- Shen, Z. X., et al. Mineralocorticoid Receptor Deficiency in Macrophages Inhibits Atherosclerosis by Affecting Foam Cell Formation and Efferocytosis. Journal of Biological Chemistry. 292 (3), 925-935 (2017).
- Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection. Frontiers in Immunology. 9, 1777 (2018).
- Hamon, R., et al. Bushfire smoke is pro-inflammatory and suppresses macrophage phagocytic function. Science Reports. 8 (1), 13424 (2018).
- Angsana, J., Chen, J., Liu, L., Haller, C. A., Chaikof, E. L. Efferocytosis as a regulator of macrophage chemokine receptor expression and polarization. European Journal of Immunology. 46 (7), 1592-1599 (2016).
- Karaji, N., Sattentau, Q. J. Efferocytosis of Pathogen-Infected Cells. Frontiers in Immunology. 8, 1863 (2017).
- Brouckaert, G., et al. Phagocytosis of necrotic cells by macrophages is phosphatidylserine dependent and does not induce inflammatory cytokine production. Molecular Biology of the Cell. 15 (3), 1089-1100 (2004).
- Gonzalez-Guevara, E., et al. Exposure to ozone induces a systemic inflammatory response: possible source of the neurological alterations induced by this gas. Inhalation Toxicology. 26 (8), 485-491 (2014).
- Robertson, S., et al. CD36 mediates endothelial dysfunction downstream of circulating factors induced by O3 exposure. Toxicological Sciences. 134 (2), 304-311 (2013).
- Kilburg-Basnyat, B., et al. Specialized Pro-Resolving Lipid Mediators Regulate Ozone-Induced Pulmonary and Systemic Inflammation. Toxicological Sciences. 163 (2), 466-477 (2018).
- Jakab, G. J., Spannhake, E. W., Canning, B. J., Kleeberger, S. R., Gilmour, M. I. The effects of ozone on immune function. Environ Health Perspect. 103 Suppl 2, 77-89 (1995).
- Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone. Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).
- Nayak, D. K., Mendez, O., Bowen, S., Mohanakumar, T. Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages. Journal of Visualized Experiments. 10 (134), (2018).
- Tao, H., et al. Macrophage SR-BI mediates efferocytosis via Src/PI3K/Rac1 signaling and reduces atherosclerotic lesion necrosis. Journal of Lipid Research. 56 (8), 1449-1460 (2015).
- Coe, L. M., et al. FGF-23 is a negative regulator of prenatal and postnatal erythropoiesis. Journal of Biological Chemistry. 289 (14), 9795-9810 (2014).
- Yong, W. K., Abd Malek, S. N. Xanthohumol induces growth inhibition and apoptosis in ca ski human cervical cancer cells. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. , 921306 (2015).
- Van de Laar, L., et al. Yolk Sac Macrophages, Fetal Liver, and Adult Monocytes Can Colonize an Empty Niche and Develop into Functional Tissue-Resident Macrophages. Immunity. 44 (4), 755-768 (2016).
- Lavin, Y., et al. Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment. Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).
- Beattie, L., et al. Bone marrow-derived and resident liver macrophages display unique transcriptomic signatures but similar biological functions. Journal of Hepatology. 65 (4), 758-768 (2016).
- Svedberg, F. R., et al. The lung environment controls alveolar macrophage metabolism and responsiveness in type 2 inflammation. Nature Immunology. , (2019).
- Crowther, J. E., et al. Pulmonary surfactant protein a inhibits macrophage reactive oxygen intermediate production in response to stimuli by reducing NADPH oxidase activity. Journal of Immunology. 172 (11), 6866-6874 (2004).
- Silveyra, P., Floros, J. Genetic variant associations of human SP-A and SP-D with acute and chronic lung injury. Frontiers in Bioscience. 17, 407-429 (2012).
- Schagat, T. L., Wofford, J. A., Wright, J. R. Surfactant protein A enhances alveolar macrophage phagocytosis of apoptotic neutrophils. Journal of Immunology. 166 (4), 2727-2733 (2001).
- Gomez Perdiguero, E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- Nebbioso, A., et al. Time-resolved analysis of DNA-protein interactions in living cells by UV laser pulses. Scientific Reports. 7 (1), 11725 (2017).
- Novak, Z., et al. Efficacy of different UV-emitting light sources in the induction of T-cell apoptosis. Photochemistry and Photobiology. 79 (5), 434-439 (2004).
- Park, Y. J., et al. PAI-1 inhibits neutrophil efferocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (33), 11784-11789 (2008).
- Kleeberger, S. R., Reddy, S., Zhang, L. Y., Jedlicka, A. E. Genetic susceptibility to ozone-induced lung hyperpermeability: role of toll-like receptor 4. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 22 (5), 620-627 (2000).
- Wesselkamper, S. C., Chen, L. C., Kleeberger, S. R., Gordon, T. Genetic variability in the development of pulmonary tolerance to inhaled pollutants in inbred mice. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 281 (5), L1200-L1209 (2001).
