In vivo-bedömning av alveolära Makrofagefferocytos efter exponering för ozon
Summary
Detta manuskript beskriver ett protokoll för att avgöra om exponering för ozon, ett kriterium luftförorening, försämrar alveolära makrofage efferocytos in vivo. Detta protokoll använder vanliga reagenser och tekniker och kan anpassas till flera modeller av lungskada för att fastställa effekter på alveolära makrofagen efferocytos.
Abstract
Ozon (O3) är ett kriterium luftförorening som förvärar och ökar incidensen av kroniska lungsjukdomar. O3 exponering är känd för att framkalla lunginflammation, men lite är känt om hur exponeringen förändrar processer som är viktiga för upplösningen av inflammation. Efferocytosis är en resolution process, varvid makrofager fagocytize apoptotiska celler. Syftet med detta protokoll är att mäta alveolära makrofage efferocytos efter O3-inducerad lungskada och inflammation. Flera metoder har beskrivits för att mäta efferocytos; emellertid, de flesta kräver ex vivo manipulationer. Beskrivs i detalj här är ett protokoll för att mäta in vivo alveolära makrofage efferocytosis 24 h efter O3 exponering, som undviker ex vivo manipulation av makrofager och fungerar som en enkel teknik som kan användas för att korrekt representera störningar i Denna resolutions process. Protokollet är en tekniskt icke-intensiv och relativt billig metod som involverar hela kroppen O3 inandning följt av orofaryngeal aspiration av apoptotiska celler (dvs., Jurkat T-celler) medan under narkos. Alveolära makrofagefferocytos mäts sedan genom ljusmikroskopi utvärdering av makrofager som samlats in från bronkoalveolär (BAL) sköljning. Efferocytosis mäts slutligen genom att beräkna ett efferocytic index. Kollektivt, de beskrivna metoderna kvantifiera efferocytic aktivitet i lungan in vivo och samtidigt tjänar till att analysera de negativa hälsoeffekterna av O3 eller andra inhalerade förolämpningar.
Introduction
Lungan utsätts ständigt för miljömässiga förolämpningar, inklusive luft partiklar, virus, bakterier, och oxidationsmedel gaser som utlöser lunginflammation1,2,3. Dessa förolämpningar kan äventyra gasutbyte och framkalla irreversibel vävnadsskada4,5. Alveolära makrofager, som utgör cirka 95% av de immunceller som finns i murin och mänskliga lungor vid homeostas, är kritiska regulatorer av pulmonell inflammation efter miljö förolämpningar1,2, 3,4,5. Alveolära makrofager är viktiga under värd försvaret av fagocyterande och eliminera patogener. Nyligen, alveolära makrofager har visat sig främja vävnad homeostas och upplösning av inflammation genom efferocytosis6,7. Efferocytosis är en fagocytisk process där makrofager uppslukar och eliminera apoptotiska celler8,9,10. Efferocytosis resulterar också i produktion av medlare (i.e., Il-10, TGF-β, PGE2, och kväveoxid) att ytterligare öka processen, vilket resulterar i upplösning av inflammation9,10,11 ,12,16,18. Denna process är nödvändig för att förhindra sekundär nekros och främja vävnad homeostas12,13,14. Flera studier har kopplat nedsatt efferocytos med olika kroniska lungsjukdomar, inklusive astma, kronisk obstruktiv lungsjukdom, och idiopatisk pulmonell fibros8,9,15, 16,17.
O3 är ett kriterium luftförorening som förvärar och ökar incidensen av kroniska lungsjukdomar19,20,21. O3 inducerar lunginflammation och skada och är känt för att försämra alveolära makrofagocytos av bakteriella patogener22,23. Emellertid, det är okänt om O3 försämrar alveolära makrofagen efferocytos. Utreda O3-inducerad förändringar i alveolär makrofagefferocytos kommer att ge potentiell insikt i hur exponeringen kan leda till kronisk lungsjukdom incidens och exacerbation. Beskrivs nedan är en enkel metod för att utvärdera alveolära makrofage efferocytosis i lungorna av kvinnliga möss efter akut O3 exponering.
Metoden som beskrivs har flera fördelar jämfört med andra efferocytosis-protokoll som vanligen används inom området genom att eliminera användningen av kostsamma fluorescerande färgämnen, omfattande flödescytometrimätningar och ex vivo-manipulation av alveolära makrofager24 ,25. Dessutom, detta protokoll åtgärder alveolära makrofage efferocytos i samband med lung mikromiljön, som kan påverka makrofagfunktion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Efferocytosis är en anti-inflammatorisk process där makrofager tydliga apoptotiska celler och skräp samt producera flera anti-inflammatoriska mediatorer9,10,11,12,16 ,18. Flera modeller av efferocytosis har gett insikt i hur makrofage är en kritisk cell i resolutionen av inflammation6,<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie finansieras av hälsoeffekter Institute Walter A. Rosenblith Award och NIEHS R01ES028829 (till K. M. G). Vi vill tacka Dr Dianne Walters (Institutionen för fysiologi, ECU) för hennes hjälp med att få representativa bilder av alveolära makrofager.
Materials
| Annexin V-FITC Kit | Trevigen | 4830-250-K | The TACS Annexin V-FITC Kit allows rapid, specific, and quantitative identification of apoptosis in individual cells when using flow cytometry. |
| BCL2 Jurkat T Cells | ATCC | ATCC CRL-2899 | The BCL2 Jurkat cell line was derived by transfecting human Jurkat T cells with the pSFFV-neo mammalian expression vector containing the human BCL-2 ORF insert and a neomycin-resistant gene. Has been for models of measuring efferocytosis. |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermofisher | AMQAX1000 | It is a benchtop assay platform equipped with state-of-the-art optics, full autofocus, and image analysis software for rapid assessment of cells in suspension. Very easy to use. |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermofisher | A78300003 | Provides economical thin-layer preparations from any liquid matrix, especially hypocellular fluids such as bronchoalveolar lavage fluid. |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Thermofisher | 16140071 | Provides Nutrients to cultured cells for them to grow. It is standard for cell culture. |
| Kwik-Diff Reagent 2, Eosin | Thermofisher | 9990706 | Eosin staining that stains cytoplasm. |
| Kwik-Diff Reagent 1, Fixative | Thermofisher | 9990705 | Fixes cells to be stained by H&E. |
| Kwik-Diff Reagent 3, Methylene Blue | Thermofisher | 9990707 | Methylene Blue staining that stains the nucleus. |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma/Aldrich | P0781-100ML | Penicillin-Streptomycin is the most commonly used antibiotic solution for culture of mammalian cells. Additionally it is used to maintain sterile conditions during cell culture. |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 61870036 | RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) was originally developed to culture human leukemic cells in suspension and as a monolayer. RPMI 1640 medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells, including HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrocytes, and carcinomas. Helps grow Jurkat T cells fast and efficiently. |
| Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Crosslinker | Cambridge Scientific | 16659 | The Stratalinker UV crosslinker is designed to induce apoptosis, crosslink DNA or RNA to nylon, nitrocellulose, or nylon-reinforced nitrocellulose membranes. |
| Teledyne T400 ultraviolet light photometer | Teledyne API | T400 | The Model T400 UV Absorption analyzer uses a system based on the Beer-Lambert law for measuring low ranges of ozone in ambient air. |
| Teledyne T703 Ozone calibrator | Teledyne API | T703 | Provides feedback control of the UV lamp intensity, assuring stable ozone output. |
References
- Puttur, F., Gregory, L. G., Lloyd, C. M. Airway macrophages as the guardians of tissue repair in the lung. Immunology and Cell Biology. , (2019).
- Gregoire, M., et al. Impaired efferocytosis and neutrophil extracellular trap clearance by macrophages in ARDS. European Respiratory Journal. 52 (2), (2018).
- Fan, E. K. Y., Fan, J. Regulation of alveolar macrophage death in acute lung inflammation. Respiratory Research. 19 (1), 50 (2018).
- Michlewska, S., McColl, A., Rossi, A. G., Megson, I. L., Dransfield, I. Clearance of dying cells and autoimmunity. Autoimmunity. 40 (4), 267-273 (2007).
- Bhattacharya, J., Westphalen, K. Macrophage-epithelial interactions in pulmonary alveoli. Seminars in Immunopathology. 38 (4), 461-469 (2016).
- Donnelly, L. E., Barnes, P. J. Defective phagocytosis in airways disease. Chest. 141 (4), 1055-1062 (2012).
- Morimoto, K., Janssen, W. J., Terada, M. Defective efferocytosis by alveolar macrophages in IPF patients. Respiratory Medicine. 106 (12), 1800-1803 (2012).
- Vandivier, R. W., et al. Dysfunctional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibits phagocytosis of apoptotic cells with proinflammatory consequences. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 297 (4), L677-L686 (2009).
- Grabiec, A. M., et al. Diminished airway macrophage expression of the Axl receptor tyrosine kinase is associated with defective efferocytosis in asthma. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 1144-1146 (2017).
- Chen, W., Frank, M. E., Jin, W., Wahl, S. M. TGF-beta released by apoptotic T cells contributes to an immunosuppressive milieu. Immunity. 14 (6), 715-725 (2001).
- Gao, Y., Herndon, J. M., Zhang, H., Griffith, T. S., Ferguson, T. A. Antiinflammatory effects of CD95 ligand (FasL)-induced apoptosis. Journal of Experimental Medicine. 188 (5), 887-896 (1998).
- O’Brien, B. A., Fieldus, W. E., Field, C. J., Finegood, D. T. Clearance of apoptotic beta-cells is reduced in neonatal autoimmune diabetes-prone rats. Cell Death and Differentiation. 9 (4), 457-464 (2002).
- Shen, Z. X., et al. Mineralocorticoid Receptor Deficiency in Macrophages Inhibits Atherosclerosis by Affecting Foam Cell Formation and Efferocytosis. Journal of Biological Chemistry. 292 (3), 925-935 (2017).
- Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection. Frontiers in Immunology. 9, 1777 (2018).
- Hamon, R., et al. Bushfire smoke is pro-inflammatory and suppresses macrophage phagocytic function. Science Reports. 8 (1), 13424 (2018).
- Angsana, J., Chen, J., Liu, L., Haller, C. A., Chaikof, E. L. Efferocytosis as a regulator of macrophage chemokine receptor expression and polarization. European Journal of Immunology. 46 (7), 1592-1599 (2016).
- Karaji, N., Sattentau, Q. J. Efferocytosis of Pathogen-Infected Cells. Frontiers in Immunology. 8, 1863 (2017).
- Brouckaert, G., et al. Phagocytosis of necrotic cells by macrophages is phosphatidylserine dependent and does not induce inflammatory cytokine production. Molecular Biology of the Cell. 15 (3), 1089-1100 (2004).
- Gonzalez-Guevara, E., et al. Exposure to ozone induces a systemic inflammatory response: possible source of the neurological alterations induced by this gas. Inhalation Toxicology. 26 (8), 485-491 (2014).
- Robertson, S., et al. CD36 mediates endothelial dysfunction downstream of circulating factors induced by O3 exposure. Toxicological Sciences. 134 (2), 304-311 (2013).
- Kilburg-Basnyat, B., et al. Specialized Pro-Resolving Lipid Mediators Regulate Ozone-Induced Pulmonary and Systemic Inflammation. Toxicological Sciences. 163 (2), 466-477 (2018).
- Jakab, G. J., Spannhake, E. W., Canning, B. J., Kleeberger, S. R., Gilmour, M. I. The effects of ozone on immune function. Environ Health Perspect. 103 Suppl 2, 77-89 (1995).
- Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone. Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).
- Nayak, D. K., Mendez, O., Bowen, S., Mohanakumar, T. Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages. Journal of Visualized Experiments. 10 (134), (2018).
- Tao, H., et al. Macrophage SR-BI mediates efferocytosis via Src/PI3K/Rac1 signaling and reduces atherosclerotic lesion necrosis. Journal of Lipid Research. 56 (8), 1449-1460 (2015).
- Coe, L. M., et al. FGF-23 is a negative regulator of prenatal and postnatal erythropoiesis. Journal of Biological Chemistry. 289 (14), 9795-9810 (2014).
- Yong, W. K., Abd Malek, S. N. Xanthohumol induces growth inhibition and apoptosis in ca ski human cervical cancer cells. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. , 921306 (2015).
- Van de Laar, L., et al. Yolk Sac Macrophages, Fetal Liver, and Adult Monocytes Can Colonize an Empty Niche and Develop into Functional Tissue-Resident Macrophages. Immunity. 44 (4), 755-768 (2016).
- Lavin, Y., et al. Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment. Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).
- Beattie, L., et al. Bone marrow-derived and resident liver macrophages display unique transcriptomic signatures but similar biological functions. Journal of Hepatology. 65 (4), 758-768 (2016).
- Svedberg, F. R., et al. The lung environment controls alveolar macrophage metabolism and responsiveness in type 2 inflammation. Nature Immunology. , (2019).
- Crowther, J. E., et al. Pulmonary surfactant protein a inhibits macrophage reactive oxygen intermediate production in response to stimuli by reducing NADPH oxidase activity. Journal of Immunology. 172 (11), 6866-6874 (2004).
- Silveyra, P., Floros, J. Genetic variant associations of human SP-A and SP-D with acute and chronic lung injury. Frontiers in Bioscience. 17, 407-429 (2012).
- Schagat, T. L., Wofford, J. A., Wright, J. R. Surfactant protein A enhances alveolar macrophage phagocytosis of apoptotic neutrophils. Journal of Immunology. 166 (4), 2727-2733 (2001).
- Gomez Perdiguero, E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- Nebbioso, A., et al. Time-resolved analysis of DNA-protein interactions in living cells by UV laser pulses. Scientific Reports. 7 (1), 11725 (2017).
- Novak, Z., et al. Efficacy of different UV-emitting light sources in the induction of T-cell apoptosis. Photochemistry and Photobiology. 79 (5), 434-439 (2004).
- Park, Y. J., et al. PAI-1 inhibits neutrophil efferocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (33), 11784-11789 (2008).
- Kleeberger, S. R., Reddy, S., Zhang, L. Y., Jedlicka, A. E. Genetic susceptibility to ozone-induced lung hyperpermeability: role of toll-like receptor 4. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 22 (5), 620-627 (2000).
- Wesselkamper, S. C., Chen, L. C., Kleeberger, S. R., Gordon, T. Genetic variability in the development of pulmonary tolerance to inhaled pollutants in inbred mice. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 281 (5), L1200-L1209 (2001).
