호중구 세포 외 트랩 (NETs)은 자극 된 호중구 과립구에 의해 생성 된 3 차원 구조입니다. 최근 몇 년 동안 NET가 다양한 질병에 관여하고 있음이 분명해졌습니다. 조직에서 NET를 검출하는 것은 진단 관련성이 있을 수 있으므로 NET 성분을 라벨링하기 위한 표준화된 프로토콜이 필요합니다.
호중구 과립구는 또한 그들의 lobulated 핵 때문에 다형성 핵 백혈구 (PMN)에게 불린, 백혈구의 가장 풍부한 모형입니다. 그(것)들은 골수에서 성숙하고 말초 혈액으로 풀어 놓입니다, 그(것)들은 대략 6-8 시간 동안 순환합니다; 그러나 조직에서는 며칠 동안 생존 할 수 있습니다. 내피를 통해 diapedesis에 의해, 그들은 혈 류를 떠나, 조직을 입력, 화학 구배를 다음 감염의 사이트로 마이그레이션. 호중구는 식세포증, 탈과립 및 호중구 세포 외 트랩 (NETs)의 생성에 의해 침입 미생물을 방지 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 파라핀 내장 조직에서 NET를 검출하는 데 도움이 될 것입니다. NET는 NETosis에게 불린 프로세스의 결과입니다, 이는 살아있는 (생명 NETosis) 또는 죽어가는 (자살 NETosis) 호중구에서 핵, 과립 및 세포질 분대의 방출로 이끌어 냅니다. 시험관에서, NETs는 그(것)들이 내려온 세포의 그것 보다는 몇 배 더 큰 공간을 차지하는 구름 같이 구조물을 형성합니다. NETs의 중추는 크로마틴으로, 과립과 세포질에서 유래한 단백질과 펩티드의 선택이 결합되어 있습니다. 이에 따라, 높은 국부적 농도의 독성 화합물이 유지되어 NET가 박테리아, 곰팡이, 바이러스 및 기생충을 포함한 다양한 병원체를 포획하고 비활성화할 수 있으며, 고활성 NET 성분의 확산은 손상을 초래합니다. 인접한 조직은 제한적입니다. 그럼에도 불구하고, 최근 몇 년 동안 NETs가 풍부하게 생성되거나 불충분하게 제거되면 자가 면역 질환에서 암에 이르는 병리학적 잠재력을 가지고 있다는 것이 명백해졌습니다. 따라서, 조직 샘플에서 NET의 검출은 진단의 중요성을 가질 수 있으며, 병에 걸린 조직에서 NET의 검출은 환자의 치료에 영향을 미칠 수 있다. 파라핀 내장 조직 샘플은 병리학 적 분석에 사용되는 표준 표본이기 때문에 시판되는 항체를 사용하여 파라핀 내장 조직에서 NET 성분의 형광 염색프로토콜을 확립하고자 했습니다.
호중구 세포외 트랩(NET)은 복잡한 3차원 구조를 갖는다. 고해상도 스캐닝-전자 현미경 분석은 15-20 nm (크로마틴)의 직경을 가진 매끄러운 섬유로 이루어져 있다는 것을 밝혔습니다 >25 nm의 구형 도메인으로 박힌 약 30 개의 과립 및 세포질의 구색으로 구성 단백질 및 펩티드1,2. 분리된 호중구로부터 시험관 내에서 생성될 때, NET는 면역형광에 의해 두 개 이상의 성분의 염색에 의해 식별될 수 있다(예를 들어, 히스톤 및 호중구 엘라스타제 [NE]). 자극되지 않은 다형성 핵 백혈구 (PMN)에서, 히스톤은 핵에서 독점적으로 위치하며 NE는 과립에 포함되어 있습니다. NETosis 동안, NE는 히스톤3,4를처리하는 핵에 들어갑니다. NET는 비자극 호중구에서 명확하게 분리되는 성분의 공동 국소화가 특징입니다. 현재 NET 특이적 에피토프(즉, 순진한 호중구와 반응하지 않음)를 독점적으로 검출하는 항체가 존재하지 않기 때문에, NET에서 호중구 단백질의 동국화를 검출하는 것이 NET를 식별하는 유일한 방법입니다.
조직에서, NET는 거의 기존의 조직 학적 얼룩에 의해 검출 될 수 없다 (예를 들어, 헤마톡신 / 에오신 [H&E]로 염색하여, 이는 확산 창백한 푸른 색조로 NET를 묘사). 높은 풍부한 경우에만, NET는 명확하게 트롬비5와같은 H & E 염색으로 구별 될 수있다. NET는 그 것 당 확산되기 때문에, 조직 구조는 최적으로 보존되어야 합니다, 그래서 동결 유물을 유도하는 경향이 있는 저온 준비는 조직에 있는 NETs의 분석을 위해 최적이 아닙니다. 대신, 포름알데히드 고정 및 파라핀 포함은 조직 웰2에서NET 구조를 보존하는 것으로 나타났다. (면역-) 파라핀 내장 된 조직의 단면의 조직학적 검사는 병리학 적 분석을위한 표준 방법입니다. 파라핀 블록의 조직이 실온(RT)에서도 보존되기 때문에, 매일 진단 작업의 조직 표본은 수년 전에 준비된 표본과 비교할 수 있으며, 최근에 생겨난 질문과 기술로 볼 수 있습니다. 조직에 있는 NET는 최근까지 검출되지 않으며, 질병의 과정 도중 그물 대형 그리고 제거의 상세한 분석은 병인에 새로운 통찰력으로 이끌어 낼 수 있습니다. 파라핀 내장 된 조직의 사용은 아카이브 물질의 분석을 허용하고 소급 연구를 수행 할 수있는 귀중한 장점을 갖는다6. 명백하게, 이러한 혜택은 비용에 와서. 파라핀에 포함시키기 전에, 조직은 포름알데히드 고정, 탈수 및 50 °C 이상으로 가열되어야 한다. 이 절차는 조직 자동 형광뿐만 아니라 에피토프 마스킹을 유도합니다.
고정 아티팩트를 제한하려면 고정 시간을 최소한으로 유지해야 하므로 조직 샘플의 크기는 ~ 3mm 두께의 20mm x 30mm 영역을 초과해서는 안됩니다. 이 크기의 샘플은 포름알데히드에서 RT에서 하룻밤 배양 한 후 완전히 고정되며, 이상적으로 직접 탈수 및 파라핀 포함이 뒤따릅니다. 또는 고정 샘플을 버퍼에서 1일 또는 2일 동안 저장할 수 있습니다. 면역형광 연구의 경우, 고정제는 적합한 완충액(예를 들어, 인산완충식염수[PBS] 또는 트리스 완충식염수[TBS]])에 용해된 파라포름알데히드로부터 신선하게 제조되어야 한다. 고정 제제 동안 포심산 형성을 방지하기 위해 온도를 60 °C 이하로 유지해야합니다. 병리학의 표준 고정제인 포르말린은 메탄올, 다른 알데히드, 케톤 및 포름산을 함유하고 있기 때문에 사용해서는 안됩니다. 이러한 불순물은 증가 된 에피토프 마스킹 및 중요한 조직 자가 형광으로 이어질.
성공적인 면역 표지를 위해, 에피토프 마스킹은 항원 회수에게 불린 프로세스에서 되돌려져야 합니다. 조직 절편은 메틸렌 다리를 부러 뜨리는 것으로 여겨지는 적절한 완충액으로 가열되므로 에피토프는 항체7에접근 할 수 있게됩니다. NET의 검출을 위해, 열 유도 에피토프 회수(HIER)는 프로테오라틱 효소의 사용과 같은 다른 방법에 바람직하다. 일상적으로, 파라핀 단면도의 면역 표지는 침전기로 검출되는 peroxidase 표지된 이차 항체에 선행된 단 하나 항체로 수행됩니다. 면역형광에 비해, 효소 계 검출 방법은 기질 침전물의 확산으로 인한 낮은 공간 분해능을 가지며, 일반적으로 하나 이상의 항원의 동시 검출이제한된다 6.
현재 NET에 독점적으로 결합하는 항체가 존재하지 않기 때문에,이 프로토콜은 두 개의 단백질, 핵인 히스톤 2B 및 과립으로 국한된 호중구 엘라스타아제에 라벨을 붙이는 데 사용됩니다. 자극되지 않은 호중구에서, 이 단백질은 분리됩니다, 그러나 NETosis를 겪고 있는 호중구및 NETs에서 공국화됩니다. 2개의 항원의 동시 검출은 다른 호스트및 다른 불소로 표지된 2개의 종 특정 이차 항체에서 제기된 2개의 1 차적인 항체로 달성될 수 있습니다. 이 보고서는 이전에 발표된 프로토콜8의 표준화이며 인간 및 뮤린 기원의 파라핀 내장 조직에서 NET 성분을 신선및 보관모두에서 안정적으로 염색하는 두 가지 상용 항체의 조합을 사용합니다.
병인발생시 NET의 역할에 대한 인식이 높아짐에 따라 환자 또는 실험 동물로부터 조직에서의 검출이 점점 더 중요해지고 있습니다. 파라핀 내장 조직 샘플은 다른 조직 제제(예를 들어, 저온 보존된 시편의 단면도)에 비해 많은 장점을 갖는다. 파라핀 내장 샘플의 조직 보존은 분명히 우수하며, 일단 삽입되면 샘플이 수십 년 동안 보존되어 역행 연구가 가능합니다. 선조 구조인 NET를 검출하기 위해 양호한 시료 보존은 얼음 결정 형성으로 인해 조직 손상이 발생하기 쉬운 저온 보존 물질의 사용을 배제하는 전제 조건이며, 이는 형태학적으로 유사한 유물을 야기할 수 있습니다. 그물.
최적의 보존을 위해 실험 동물의 조직은 자가 분해를 피하기 위해 이상적으로 관류에 의해 사후 직후에 고정해야합니다. TBS 또는 PBS 광석과 같은 적당한 완충액에서 파라포름알데히드의 고정, 신선 하게 제조 또는 갓 해동된 용액으로 최적입니다. 이것은 표준 조직학에 사용되는 포르말린 제제와 는 대조적으로 화학적으로 정의되며, 적은 조직 자가 형광을 유도한다. 대조적으로, 인간 조직은 종종 절제 후 직접 고정되지 않으며, 고정제로, 일반적으로 포르말린의 10 % 희석은 중합을 방지하기 위해 안정제로 메탄올의 10 % ~ 15 %를 포함하는 활용, 뿐만 아니라 포름산, 다른 알데히드, 케톤 . 종종 조직은 포함하기 전에 오랜 시간 동안이 고정제에 저장됩니다. 결과는 자동 해(절제와 고정 사이의 시간에 따라 다름) 및 과다한 수정으로 인한 메틸렌 브리지의 과도한 형성일 수 있습니다. 포름알데히드 고정은 인트라-및 분자 간 메틸렌브리지(10)의형성에 의해 단백질의 삼차 구조의 변화를 유도한다. 핵산, 탄수화물 및 지질과 같은 비단백질 세포 성분은 직접 고정되지 않고 3차원 단백질 네트워크에서 고정됩니다. 성공적인 라벨링을 위해, 메틸렌 결합은 항원 검색 과정에서 에피토프를 노출시키기 위해 깨져야 한다. 이는 적합한 열 유도 항원 회수 완충제(HIER buffer)(11)에서현미경 슬라이드상에 장착된 조직 섹션의 가열에 의해 달성된다. 우리의 이전 연구는 파라핀화된 조직에서 NET 성분의 검출에 대한 HIER 완충제의 pH 및 온도의 영향을 분석하였으며, 한 성분에 대한 성공적인 조직 전처리가 종종 제2 성분에 대해 최적이 아닌 것으로 나타났다8.
그 동안, 9의 pH에서 HIER 버퍼에서 70 °C로 조직을 가열하는 것은 많은 NET 구성 요소에 대한 좋은 타협이며, 종종 더 높은 온도에서 손상되는 좋은 조직 보존을 유지하는 것으로 나타났습니다. 시작점으로 표시된 검색 시간을 사용하는 것이 제안되지만, 특히 알려지지 않은 고정 매개변수의 보관 시편에서는 염색 강도가 만족스럽지 않을 수 있습니다. 이 경우, 회수 절차 동안 온도의 연장 또는 더 높은 염색 효율을 향상시킬 수 있다. 이것은 또한 우리의 프로토콜에 사용된 IgY 항체의 히스톤 2B 염색에 영향을 미칠 수 있다. 그림 1에나타난 바와 같이, 데콘덴세드 염색질은 NETosis를 겪고 있는 호중구뿐만 아니라 NETs 에서 발견될 수 있으며, 이 항체로 훨씬 더 강한 얼룩은 호중구를 쉬는 크로마틴에 비해 훨씬 더 강하다. 이것은 아마 압축 핵에 180 kDa IgY 분자의 제한된 접근 때문이 증가 된 에피토프 회복 후에 다를 수 있습니다. 이것은 응축된 염색질의 지역에서조차 결합 효율성을 강화할 수 있습니다, 호중구및 그밖 세포의 일반적인 핵에 있는 강한 형광 귀착될 것입니다. NETosis를 겪고 있는 호중구와 비자극된 호중구 사이의 염색 효율의 차이는 그림 1에묘사된 것보다 덜 두드러질 수 있습니다. 그물 형성의 지역은 아직도 NE, H2B 및 DNA의 공동 현지화에 의해 확인될 것입니다.
고정 절차는 또한 스펙트럼의 푸르스름 / 녹색 부분에서 주로 조직의 상당한 자가 형광을 유도 할 수 있습니다. 청색 여기와 함께 사용되는 불소의 방출 최대값과 일치하는 적절한 협대역 광형 필터 세트(와이드 필드) 또는 검출기 설정(공초점)을 사용하여 이러한 자동 형광의 대부분을 피하는 것이 중요합니다(예: Cy2, Alexafluor) 488. 극단적 인 자가 형광의 경우 스펙트럼의 푸르스름 / 녹색 부분을 피해야합니다. 대신, 형광 신호는 스펙트럼의 먼 빨간 부분 (예를 들어, Cy 5 또는 Alexafluor 635에 결합된 이차 항체)에서 쉽게 검출될 수 있지만, 이것은 필터링이 없는 흑백 카메라 또는 공초점 현미경을 필요로 한다. 인간의 눈은 600 nm를 초과하여 다소 민감하지 않으므로, 멀리 적색 형광 신호는 거의 안구를 사용하여 검출 될 수 없다. 어쨌든, 적당한 노출 시간 또는 검출기 설정을 결정하기 위하여 부정적인 통제 (예를 들면, 1 차적인 항체 또는 생략하는 1 차적인 항체 대신에 비면역 혈청/이소타입 통제)를 사용하는 것이 중요합니다.
1-2 μm의 조직 단면도는 10x 또는 20x 목표를 사용하여 광시야 현미경으로 분석될 수 있습니다. 이 렌즈는 큰 초점 깊이를 제공하므로 (거의) 전체 조직 섹션이 초점에 있을 것입니다. 이는 충분히 큰 경우 (그림 1에서와같이) NET 형성 부위에 대한 조직 섹션을 신속하게 스캔하는 데 사용할 수 있습니다. 녹색(NE), 적색(H2B) 및 청색(DNA) 채널의 공동 국소화는 그물 형성영역을 나타내는 백색 염색을 초래한다(도1G). 더 높은 배율을 위해서는 공초점 또는 데콘볼루션이 있는 광시야 현미경이 필요합니다. 도 2는 도 1에사용되는 인간 장수염 시편의 세부 사항을 나타낸다. 도 2A에서,NE는 작은 점(과립)으로 국소화되지만, 큰 비율은 세포외이며, 종종 H2B(그림 2B)와 중첩되는 줄무늬를 형성한다(도2C). 이러한 공동 지역화는 NET(그림2D)를나타내는 희끄무레한 오버레이를 초래합니다. M. 결핵에 감염된 마우스의 폐 섹션에서 매우 유사한 패턴을 발견할 수있다(그림 3).
여기에 제시된 시편은 낮은 배율에서도 식별할 수 있는 높은 수준의 NET 형성을 가진 영역을 특징으로 합니다. 조직 밀도 및 각각의 자극에 따라, NET 형성은 호중구의 작은 그룹의 NET 형성에 이르기까지 훨씬 덜 발음 될 수 있습니다 (심근염의 예로, 이전 간행물12참조). 이 프로토콜은 조직에 있는 NETs에 대한 더 많은 연구를 육성하고 질병의 대형 또는 예방에 있는 NETs의 인식되지 않는 역할을 해명하는 것을 희망하는 도움이 될 것이라는 점을 믿습니다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 공개 할 것이 없다.
bovine serum albumine | Sigma | A7906 | |
chicken anti Histone 2B antibody | Abcam | ab 134211 | |
cold water fish gelatine | Sigma-Aldrich | G7765 | |
donkey anti chicken antibody, Cy3 conjugated, for multiple labelling | Jackson Immuno Research | 703-165-155 | |
donkey anti rabbit antibody, Cy2 conjugated, for multiple labelling | Jackson Immuno Research | 711-225-152 | alternatively Cy5 conjugate, 711-175-152 |
embedding cassettes | Roth | K116.1 | |
embedding molds | Sakura | 4162 | |
embedding station | Microm | AP280 | |
ethanol | Roth | 9065.4 | |
filter paper, rolled | OCB | ||
forceps | Dumont | 7a | |
glass cylinder with 20 cm diameter | VWR | 216-0075 | |
glycerol | Roth | 3783.1 | |
HIER buffer pH 9 | Scytek | TES999 | |
Hoechst 33342 | Sigma | 14533 | |
incubator (dry, up to 40 °C) | Memmert | MMIPP30 | |
moist chamber (plastic box with tight lid) | Emsa | 508542 | |
Mowiol 40-88 | Aldrich | 32.459-0 | |
normal donkey serum | Merck | S30 | |
PAP-pen ImmEdge | Vector Lab | H-4000 | |
paraffin microtome | Microm | 355S | water bath included |
paraformaldehyde | Aldrich | 16005 | |
petri dishes | Schubert /Weiss | 7020051 | |
rabbit anti ELANE antibody | Atlas | HPA068836 | |
racks, jars for microscope slides | Roth | H554.1 H552.1 | |
scalpel | Braun | Fig.22 | |
Superfrost Plus glass slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
temperature-controlled hot plate | NeoLab | D6010 | |
tissue processor for paraffin embedding | Leica | TP1020 | |
Tris buffered saline TBS | VWR | 788 | |
Triton X100 | Roth | 3051.4 | |
Tween 20 | Fluka | 93773 | |
water bath 37 °C | GFL | 1052 | |
widefield or confocal microscope | Leica | DMR, SP8 | |
xylene (dimethylbenzene) | Roth | 9713.3 |