Le trappole extracellulari neutrofilo (NET) sono strutture tridimensionali generate da granulociti neutrofili stimolati. È diventato chiaro negli ultimi anni che i NET sono coinvolti in una vasta gamma di malattie. Il rilevamento di RETI nei tessuti può avere rilevanza diagnostica, quindi sono necessari protocolli standardizzati per l’etichettatura dei componenti NET.
I granulociti di neutrofilo, chiamati anche leucociti polimorfonucleari (PMN) a causa del loro nucleo lobulato, sono il tipo più abbondante di leucociti. Maturano nel midollo osseo e vengono rilasciati nel sangue periferico, dove circolano per circa 6-8 h; tuttavia, nei tessuti, possono sopravvivere per giorni. Con la diapedesi attraverso l’endotelio, lasciano il flusso sanguigno, entrano nei tessuti e migrano verso il sito di un’infezione a seguito di gradienti chemiotattici. I neutrofili possono combattere i microrganismi invasori mediante fagocitosi, degranlazione e generazione di trappole extracellulari neutrofiche (NET). Questo protocollo aiuterà a rilevare i NET nel tessuto incorporato in paraffina. I NET sono il risultato di un processo chiamato NETosis, che porta al rilascio di componenti nucleari, granulari e citoplasmici sia da vivere (NETosi vitale) che dalla morte (suicida NETosis) neutrofili. In vitro, i NET formano strutture simili a nuvole, che occupano uno spazio diverse volte più grande di quello delle cellule da cui discendono. La spina dorsale dei NET è la cromatina, a cui sono legati una selezione di proteine e peptidi provenienti da granuli e citoplasma. Di conseguenza, viene mantenuta un’elevata concentrazione locale di composti tossici in modo che i NET possano catturare e inattivare una varietà di patogeni, tra cui batteri, funghi, virus e parassiti, mentre la diffusione dei componenti NET altamente attivi che portano a danni tessuto adiacente è limitato. Tuttavia, negli ultimi anni è diventato evidente che le NET, se generate in abbondanza o cancellate in modo insufficiente, hanno un potenziale patologico che va dalle malattie autoimmuni al cancro. Pertanto, il rilevamento di NET nei campioni di tessuto può avere un significato diagnostico e il rilevamento di NET nel tessuto malato può influenzare il trattamento dei pazienti. Poiché i campioni di tessuto incorporato nella paraffina sono l’esemplare standard utilizzato per l’analisi patologica, è stato cercato di stabilire un protocollo per la colorazione fluorescente dei componenti NET nel tessuto incorporato nella paraffina utilizzando anticorpi disponibili in commercio.
Le trappole extracellulari neutrofilo (NET) hanno una complessa struttura tridimensionale. L’analisi microscopica ad alta risoluzione della scansione elettroquina ha rivelato che sono costituiti da fibre lisce con un diametro di 15-20 nm (cromatina) costellate di domini globulari di >25 nm che presumibilmente consistono in un assortimento di circa 30 granulari e citoplasmamici proteine e peptidi1,2. Quando generati in vitro da neutrofili isolati, i NET possono essere identificati dalla colorazione di due o più dei loro componenti mediante immunofluorescenza (ad esempio, istoni e elastasi neutrofili [NE]). Nei leucociti polimorfonucleari non stimolati (PMN), gli istoni si trovano esclusivamente nel nucleo, mentre NE è contenuto in granuli. Durante NETosis, NE entra nel nucleo, dove elabora gli istoni3,4. I NET sono caratterizzati dalla colocalizzazione dei componenti, che sono chiaramente separati in neutrofili non stimolati. Poiché attualmente non esistono anticorpi che rilevano esclusivamente epitopi specifici NET (cioè non reagiscono con neutrofili ingenui), rilevare la colocalizzazione delle proteine dei neutrofili nei NET è l’unico modo per identificare i NET.
Nel tessuto, i NET difficilmente possono essere rilevati dalle macchie istologiche convenzionali (ad esempio, colorando con l’ematossilina/eosin [H&E], che raffigura i NET come una tinta bluastra pallida diffusa). Solo quando altamente abbondanti, i NET possono chiaramente essere distinti con la colorazione H&E, come in trombi5. Poiché i NET sono diffusi di per sé, la struttura dei tessuti deve essere preservata in modo ottimale, quindi i crio-preparati che sono inclini a indurre artefatti di congelamento sono non ottimali per l’analisi dei NET nel tessuto. Invece, la fissazione della formaldeide e l’incorporamento della paraffina hanno dimostrato di preservare la struttura NET nel pozzo dei tessuti2. L’ispezione immuno-)logica di sezioni di tessuto incorporato in paraffina è il metodo standard per l’analisi patologica. Poiché il tessuto nei blocchi di paraffina viene conservato anche a temperatura ambiente (RT), i campioni di tessuto provenienti dal lavoro diagnostico quotidiano possono essere confrontati con campioni che sono stati preparati anni fa, con domande e tecniche che sono recentemente sorte. I NET nel tessuto non sono stati rilevati fino a poco tempo fa, e l’analisi dettagliata della formazione e della rimozione della rete durante il corso delle malattie può portare a nuove conoscenze sulla patogenesi. L’uso di tessuto incorporato in paraffina ha il vantaggio inestimabile per consentire l’analisi del materiale d’archivio e condurre studi retrospettivi6. Innegabilmente, questi benefici hanno un costo. Prima di incorporare in paraffina, il tessuto deve essere fissato con formaldeide, disidratato e riscaldato sopra i 50 gradi centigradi. Queste procedure inducono l’autofluorescenza dei tessuti e il mascheramento dell’epitopo.
Per limitare gli artefatti di fissazione, il tempo di fissaggio deve essere ridotto al minimo, in modo che la dimensione dei campioni di tessuto non superi un’area di 20 mm x 30 mm con spessore di 3 mm. I campioni di queste dimensioni sono completamente fissati dopo l’incubazione notturna a RT in formaldeide, idealmente seguita da disidratazione diretta e incorporamento paraffina. In alternativa, i campioni fissi possono essere conservati per 1 o 2 giorni nel buffer. Per gli studi di immunofluorescenza, il fissativo deve essere preparato fresco dalla paraformaldeide disciolta in un buffer adatto (ad esempio, la salina con buffer fosfato [PBS] o la saliera con buffer di Tris [TBS]). Durante la preparazione fissativa, la temperatura deve essere mantenuta al di sotto dei 60 gradi centigradi per evitare la formazione di acido formico. La formalina, che è un fissativo standard per la patologia, non deve essere utilizzata in quanto contiene metanolo, altre aldeidi, chetoni e acido formico. Queste impurità portano ad una maggiore mascheramento epitopiano e all’autofluorescenza significativa dei tessuti.
Per un immunolabelling di successo, il mascheramento dell’epitopo deve essere ripristinato in un processo chiamato recupero dell’antigene. Le sezioni di tessuto sono riscaldate in un buffer adatto, che si crede per rompere i ponti di metilene, quindi gli epitopi diventano accessibili agli anticorpi7. Per la rilevazione di NET, il recupero dell’epitopo indotto dal calore (HIER) è preferito ad altri metodi come l’uso di enzimi proteolitici. Regolarmente, l’immunoetichettatura delle sezioni di paraffina viene effettuata con un singolo anticorpo seguito da un anticorpo secondario etichettato perossidasi, che viene rilevato con un substrato precipitante. Rispetto all’immunofluorescenza, i metodi di rilevamento basati su enzimi hanno una risoluzione spaziale inferiore a causa della diffusione del precipitato del substrato e, in generale, il rilevamento simultaneo di più di un antigene è limitatoa 6.
Poiché attualmente non esistono anticorpi che si legano esclusivamente ai NET, questo protocollo viene utilizzato per etichettare due proteine, glistone 2B, che è nucleare, e l’elabosi dei neutrofili, che è localizzata in granuli. Nei neutrofili non stimolati, queste proteine sono separate, ma sono colocalizzate in neutrofili sottoposti a NETosis e in NET. Il rilevamento simultaneo di due antigeni può essere ottenuto con due anticorpi primari sollevati in diversi ospiti e due anticorpi secondari specifici per specie etichettati con fluorocrodiversi diversi. Questa relazione è una standardizzazione del nostro protocollo8 pubblicato in precedenza e utilizza una combinazione di due anticorpi disponibili in commercio che macchiano in modo affidabile i componenti NET nel tessuto incorporato in paraffina, sia fresco che d’archivio, di origine umana e murina.
Con la crescente consapevolezza del ruolo dei NET durante la patogenesi9, la loro rilevazione nel tessuto da pazienti o animali sperimentali sta acquistando sempre maggiore importanza. I campioni di tessuto incorporati nella paraffina presentano una serie di vantaggi rispetto ad altri preparati tissutali (ad esempio, sezioni di campioni crioconservati). La conservazione dei tessuti nei campioni incorporati in paraffina è chiaramente superiore, e una volta incorporati, i campioni vengono conservati per decenni, consentendo studi retrogradi. Per la rilevazione di NET, che sono strutture in filigrana, una buona conservazione del campione è una precondizione che esclude l’uso di materiale crioconservato, che è soggetto a danni ai tessuti dovuti alla formazione di cristalli di ghiaccio che possono dare origine a manufatti morfologicamente simili Reti.
Per una conservazione ottimale, il tessuto proveniente da animali sperimentali dovrebbe essere fissato poco dopo la morte, idealmente per perfusione, per evitare l’autolisi. Come soluzioni fissative, appena preparate o appena scongradite di paraformaldeide in un buffer adatto come TBS o PBS minerale ottimale. Questo è chimicamente definito in contrasto con i preparati formalina utilizzati per l’istologia standard, e induce meno autofluorescenza dei tessuti. Al contrario, il tessuto umano spesso non è fissato direttamente dopo l’escissione, e come fissativo, normalmente viene utilizzata una diluizione del 10% della formalina che contiene dal 10% al 15% del metanolo come stabilizzatore per prevenire la polimerizzazione, così come l’acido formica, altre aldeidi e chetoni . Spesso, il tessuto viene immagazzinato in questo fissativo per lunghi intervalli di tempo prima dell’incorporamento. Il risultato può essere l’autolisi (a seconda del tempo che intercorre tra l’escissione e la fissazione) e l’eccessiva formazione di ponti di metilene a causa della sovrafissazione. La fissazione della formaldeide induce cambiamenti nella struttura terziaria delle proteine mediante la formazione di ponti di metilene intra e intermolecolari10. I componenti cellulari non proteici come gli acidi nucleici, i carboidrati e i lipidi non sono fissati direttamente, ma immobilizzati nella rete proteica tridimensionale. Per un’etichettatura di successo, i legami di metilene devono essere rotti per esporre gli epitopi nel processo di recupero dell’antigene. Ciò si ottiene riscaldando le sezioni di tessuto montate su vetrini al microscopio in un buffer di recupero antigene indotto dal calore adatto (tampone HIER)11. Il nostro studio precedente ha analizzato l’influenza del pH e della temperatura dei buffer HIER sulla rilevazione di componenti NET nel tessuto paraffinato, ed è stato scoperto che il pretrattamento dei tessuti di successo per un componente spesso è non ottimale per un secondo componente8.
Nel frattempo, è stato scoperto che il riscaldamento del tessuto a 70 s nel buffer HIER a un pH di 9 è un buon compromesso per molti componenti NET e manterrà una buona conservazione dei tessuti, che è spesso compromessa a temperature più elevate. Si propone di utilizzare il tempo di recupero indicato come punto di partenza, ma soprattutto con campioni di archiviazione di parametri di fissazione sconosciuti, l’intensità di colorazione può essere insoddisfacente. In questo caso, il prolungamento di temperatura o superiore durante la procedura di recupero può migliorare l’efficienza di colorazione. Questo può anche influenzare la colorazione istone 2B dell’anticorpo IgY utilizzato nel nostro protocollo. Come mostrato nella Figura 1, la cromatina decondensata può essere trovata nei neutrofili sottoposti a NETosis e nelle macchie NET molto più forti con questo anticorpo rispetto alla cromatina nei neutrofili a riposo. Ciò è probabilmente dovuto all’accesso limitato della molecola 180 kDa IgY per compattare i nuclei e può differire dopo un aumento del recupero dell’epitopo. Questo può intensificare l’efficienza di legame anche in aree di cromatina condensata, che si tradurrà in una maggiore fluorescenza nei nuclei normali di neutrofili e altre cellule. La differenza di efficienza di colorazione tra neutrofili sottoposti a NETosi e neutrofili non stimolati potrebbe essere meno pronunciata di quanto illustrato nella Figura 1. Le aree di formazione della rete sarebbero ancora identificate dalla co-localizzazione di NE, H2B e DNA.
La procedura di fissazione può anche indurre una significativa autofluorescenza del tessuto, principalmente nella parte bluastra/verdastra dello spettro. È importante evitare la maggior parte di questa autofluorescenza utilizzando adeguati set di filtri a fluorescenza a passata stretta (wide-field) o impostazioni del rivelatore (confocale) che corrispondono al massimo di emissione del fluorocro mutuatismo utilizzato con eccitazione blu, ad esempio Cy2, Alexafluor 488. In casi estremi di autofluorescenza, la parte bluastra/verdastra dello spettro deve essere evitata. Invece, i segnali di fluorescenza possono essere rilevati più facilmente nella parte molto rossa dello spettro (ad esempio, anticorpi secondari accoppiati a Cy 5 o Alexafluor 635), ma questo richiede telecamere bianche/bianche senza filtro o microscopi confocali. Poiché l’occhio umano è piuttosto insensibile oltre i 600 nm, i segnali di fluorescenza molto rossi difficilmente possono essere rilevati usando oculari. In ogni caso, è importante utilizzare controlli negativi (ad esempio, controlli serali/isotipi non immuni al posto di anticorpi primari o che omettono anticorpi primari) per determinare i tempi di esposizione o le impostazioni dei rivelatori adatti.
Le sezioni di tessuto di 1x2m possono essere analizzate con microscopi ad ampio campo utilizzando obiettivi 10x o 20x. Queste lenti forniscono una grande profondità focale, quindi (quasi) l’intera sezione tissutale sarà a fuoco. Questo può essere utilizzato per eseguire rapidamente la scansione di sezioni di tessuto per le aree di formazione della rete se sono sufficientemente grandi (come nella Figura 1). La colocalizzazione dei canali verde (NE), rosso (H2B) e blu (DNA) produce una colorazione bianca che indica le aree di formazione della rete (Figura 1G). Per ingrandimenti superiori, sono necessari microscopi confocali o ad ampio raggio con deconvoluzione. Figura 2 Mostra i dettagli del campione di appendicite umana utilizzato anche per la figura 1. Nella figura 2A, NE si localizza in piccoli punti (granuli), ma una grande proporzione è extracellulare, spesso formando strisce che si sovrappongono con H2B (Figura 2B) e DNA (Figura 2C). Questa colocalizzazione produce una sovrapposizione biancastra che indica i NET (Figura 2D). Un modello molto simile può essere trovato nella sezione polmonare di un topo infettato da M. tuberculosis (Figura 3).
Gli esemplari qui presentati sono caratterizzati da aree con un alto grado di formazione della rete che possono essere identificate anche a bassa ingrandimento. A seconda della densità tissutale e del rispettivo stimolo, la formazione della rete può essere molto meno pronunciata, fino alla formazione netta di piccoli gruppi di neutrofili (per esempio nella miocardite, vedi una precedente pubblicazione12). Si ritiene che questo protocollo contribuirà a promuovere ulteriori ricerche sui NET nei tessuti e, si spera, aiutano a svelare ruoli non riconosciuti di NET nella formazione o nella prevenzione delle malattie.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
bovine serum albumine | Sigma | A7906 | |
chicken anti Histone 2B antibody | Abcam | ab 134211 | |
cold water fish gelatine | Sigma-Aldrich | G7765 | |
donkey anti chicken antibody, Cy3 conjugated, for multiple labelling | Jackson Immuno Research | 703-165-155 | |
donkey anti rabbit antibody, Cy2 conjugated, for multiple labelling | Jackson Immuno Research | 711-225-152 | alternatively Cy5 conjugate, 711-175-152 |
embedding cassettes | Roth | K116.1 | |
embedding molds | Sakura | 4162 | |
embedding station | Microm | AP280 | |
ethanol | Roth | 9065.4 | |
filter paper, rolled | OCB | ||
forceps | Dumont | 7a | |
glass cylinder with 20 cm diameter | VWR | 216-0075 | |
glycerol | Roth | 3783.1 | |
HIER buffer pH 9 | Scytek | TES999 | |
Hoechst 33342 | Sigma | 14533 | |
incubator (dry, up to 40 °C) | Memmert | MMIPP30 | |
moist chamber (plastic box with tight lid) | Emsa | 508542 | |
Mowiol 40-88 | Aldrich | 32.459-0 | |
normal donkey serum | Merck | S30 | |
PAP-pen ImmEdge | Vector Lab | H-4000 | |
paraffin microtome | Microm | 355S | water bath included |
paraformaldehyde | Aldrich | 16005 | |
petri dishes | Schubert /Weiss | 7020051 | |
rabbit anti ELANE antibody | Atlas | HPA068836 | |
racks, jars for microscope slides | Roth | H554.1 H552.1 | |
scalpel | Braun | Fig.22 | |
Superfrost Plus glass slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
temperature-controlled hot plate | NeoLab | D6010 | |
tissue processor for paraffin embedding | Leica | TP1020 | |
Tris buffered saline TBS | VWR | 788 | |
Triton X100 | Roth | 3051.4 | |
Tween 20 | Fluka | 93773 | |
water bath 37 °C | GFL | 1052 | |
widefield or confocal microscope | Leica | DMR, SP8 | |
xylene (dimethylbenzene) | Roth | 9713.3 |