Les pièges extracellulaires de Neutrophile (NET) sont des structures tridimensionnelles produites par les granulocytes neutrophiles stimulés. Il est devenu clair ces dernières années que les ENe sont impliqués dans une grande variété de maladies. La détection des EAE dans les tissus peut avoir une pertinence diagnostique, de sorte que des protocoles normalisés pour l’étiquetage des composants NET sont nécessaires.
Les granulocytes de Neutrophiles, également appelés leucocytes polymorphes (PMN) dus à leur noyau lobulé, sont le type le plus abondant de leucocytes. Ils mûrissent dans la moelle osseuse et sont libérés dans le sang périphérique, où ils circulent pendant environ 6 à 8 h; cependant, dans les tissus, ils peuvent survivre pendant des jours. Par diapède par l’endothélium, ils quittent la circulation sanguine, pénètrent dans les tissus, et migrent vers le site d’une infection suivant des gradients chimiothérapeutiques. Les neutrophiles peuvent combattre les micro-organismes envahissants par la phagocytose, la dégranulation et la génération de pièges extracellulaires neutrophiles (NET). Ce protocole aidera à détecter les EI dans les tissus incorporés à la paraffine. Les NET sont le résultat d’un processus appelé NETosis, qui conduit à la libération de composants nucléaires, granulaires et cytoplasmiques, soit à partir de neutrophiles vivants (NETosis vitaux) ou mourants (neTosis suicidaire). In vitro, les NET forment des structures en forme de nuages, qui occupent un espace plusieurs fois plus grand que celui des cellules d’où ils descendent. L’épine dorsale des NET est la chromatine, à laquelle une sélection de protéines et de peptides provenant de granules et de cytoplasmes sont liés. Par conséquent, une forte concentration locale de composés toxiques est maintenue de sorte que les NET puissent capturer et inactiver une variété d’agents pathogènes, y compris les bactéries, les champignons, les virus et les parasites, tout en diffusant les composants NET très actifs qui causent des dommages tissu voisin est limité. Néanmoins, ces dernières années, il est devenu évident que les ENi, s’ils sont générés en abondance ou effacés insuffisamment, ont un potentiel pathologique allant des maladies auto-immunes au cancer. Ainsi, la détection des NET dans les échantillons de tissu peut avoir une signification diagnostique, et la détection des NETs dans les tissus malades peut influencer le traitement des patients. Étant donné que les échantillons de tissus incorporés à la paraffine sont le spécimen standard utilisé pour l’analyse pathologique, il a été cherché à établir un protocole pour la coloration fluorescente des composants NET dans les tissus incorporés à la paraffine à l’aide d’anticorps disponibles dans le commerce.
Les pièges extracellulaires de Neutrophile (NET) ont une structure tridimensionnelle complexe. L’analyse microscopique de balayage-électron à haute résolution a indiqué qu’elles se composent des fibres lisses avec un diamètre de 15-20 nm (chromatin) parsemés de domaines globulaires de ‘gt;25 nm qui se composent vraisemblablement d’un assortiment d’environ 30 granulaires et cytoplasmiques protéines et peptides1,2. Lorsqu’ils sont générés in vitro à partir de neutrophiles isolés, les TNE peuvent être identifiés par la coloration de deux ou plusieurs de leurs composants par immunofluorescence (p. ex., histones et neutrophile elastase [NE]). Dans les leucocytes polymorphes non stimulés (PMN), les histones sont situées exclusivement dans le noyau, tandis que le NE est contenu dans les granules. Pendant neTosis, NE entre dans le noyau, où il traite histones3,4. Les NET sont caractérisés par la colocalisation des composants, qui sont clairement séparés dans les neutrophiles non stimulés. Étant donné qu’il n’existe actuellement aucun anticorps qui détectent exclusivement les épitopes spécifiques à l’ENI (c.-à-d. ne réagissent pas avec les neutrophiles naïfs), la détection de la colocalisation des protéines neutrophiles dans les TNE est le seul moyen d’identifier les TN.
Dans les tissus, les TNE peuvent difficilement être détectées par des taches histologiques conventionnelles (p. ex., en tachant avec de l’hématoxylin/éosine [H et E], qui dépeint les EEM comme une teinte bleutée pâle diffuse). Ce n’est que lorsqu’ils sont très abondants que les NET peuvent être clairement distingués par la coloration de H et E, comme dans thrombi5. Étant donné que les EAC sont diffuses en soi, la structure tissulaire doit être préservée de façon optimale, de sorte que les cryo-préparations qui sont sujettes à induire des artefacts de congélation sont sous-optimales pour l’analyse des TN dans les tissus. Au lieu de cela, la fixation de formaldéhyde et l’embedding de paraffine a été montrée pour préserver la structure de NET dans le tissu bien2. (Immuno-)l’inspection histologique des sections de tissu paraffine-incorporée est la méthode standard pour l’analyse pathologique. Comme le tissu dans les blocs de paraffine est conservé même à température ambiante (RT), les spécimens de tissus provenant du travail diagnostique quotidien peuvent être comparés à des spécimens qui ont été préparés il y a des années, avec des questions et des techniques qui ont récemment surgi. Les TNNe dans les tissus n’ont pas été détectés jusqu’à récemment, et l’analyse détaillée de la formation et de l’élimination de l’EI au cours des maladies peut mener à de nouvelles connaissances sur la pathogénie. L’utilisation de tissus incorporés à la paraffine présente un avantage inestimable pour permettre l’analyse de documents d’archives et pour mener des études rétrospectives6. Indéniablement, ces avantages ont un coût. Avant d’incorporer de la paraffine, le tissu doit être fixé au formaldéhyde, déshydraté et chauffé au-dessus de 50 oC. Ces procédures induisent l’autofluorescence de tissu aussi bien que le masquage d’épitope.
Pour limiter les artefacts de fixation, le temps de fixation doit être réduit au minimum, de sorte que la taille des échantillons de tissus ne doit pas dépasser une superficie de 20 mm x 30 mm avec une épaisseur de 3 mm. Les échantillons de cette taille sont complètement fixés après l’incubation de nuit à RT dans le formaldéhyde, idéalement suivis par la déshydratation directe et l’intégration de paraffine. Alternativement, les échantillons fixes peuvent être stockés pendant 1 ou 2 jours dans un tampon. Pour les études d’immunofluorescence, le fixatif doit être fraîchement préparé à partir de paraformaldéhyde dissous dans un tampon approprié (p. ex., saline tamponnée en phosphate [PBS] ou saline tristamponisée [TBS]). Pendant la préparation fixative, la température doit être maintenue en dessous de 60 oC afin d’éviter la formation d’acide formique. La formaline, qui est un fixatif standard pour la pathologie, ne devrait pas être employée puisqu’elle contient le méthanol, d’autres aldéhydes, les cétones, et l’acide formique. Ces impuretés mènent au masquage accru d’épitope et à l’autofluorescence significative de tissu.
Pour l’immunoétiquetage réussi, le masquage d’épitope doit être retourné dans un processus appelé récupération d’antigène. Les sections de tissu sont chauffées dans un tampon approprié, qui est censé casser des ponts de méthylène, ainsi les épitopes deviennent accessibles aux anticorps7. Pour la détection des ENe, la récupération d’épitope induite par la chaleur (HIER) est préférable à d’autres méthodes telles que l’utilisation d’enzymes protéolytiques. Régulièrement, l’immunoétiquetage des sections de paraffine est effectué avec un seul anticorps suivi d’un anticorps secondaire étiqueté peroxidase, qui est détecté avec un substrat précipitant. Comparé à l’immunofluorescence, les méthodes de détection enzymatiques ont une résolution spatiale plus faible due à la diffusion du précipité de substrat, et généralement, la détection simultanée de plus d’un antigène est limitée6.
Comme actuellement il n’existe aucun anticorps qui se lie exclusivement aux NET, ce protocole est utilisé pour étiqueter deux protéines, l’histone 2B, qui est nucléaire, et l’élastase de neutrophile, qui est localisée dans les granules. Dans les neutrophiles non stimulés, ces protéines sont séparées, mais elles sont colocalisées dans les neutrophiles subissant la NETosis et dans les NETs. La détection simultanée de deux antigènes peut être réalisée avec deux anticorps primaires élevés chez des hôtes différents et deux anticorps secondaires spécifiques à l’espèce étiquetés avec différents fluorochromes. Ce rapport est une normalisation de notre protocole précédemment publié8 et utilise une combinaison de deux anticorps disponibles dans le commerce qui tachent de façon fiable les composants NET dans les tissus incorporés à la paraffine, frais et archivistiques, d’origine humaine et murine.
Avec la prise de conscience croissante du rôle des NET pendant la pathogénie9,leur détection dans les tissus des patients ou des animaux expérimentaux gagne en importance. Les échantillons de tissus incorporés à la paraffine présentent un certain nombre d’avantages par rapport à d’autres préparations tissulaires (p. ex., sections de spécimens cryoconservés). La conservation des tissus dans les échantillons incorporés à la paraffine est clairement supérieure, et une fois incorporés, les échantillons sont conservés pendant des décennies, ce qui permet des études rétrogrades. Pour la détection des NET, qui sont des structures en filigrane, une bonne conservation de l’échantillon est une condition préalable excluant l’utilisation de matériaux cryoconservés, qui sont sujets à des dommages aux tissus dus à la formation de cristaux de glace qui peuvent donner lieu à des artefacts ressemblant morphologiquement à Filets.
Pour une conservation optimale, les tissus des animaux expérimentaux doivent être fixés peu de temps après la mort, idéalement par perfusion, pour éviter l’autolyse. Comme fixative, fraîchement préparé ou fraîchement décongelé solutions de paraformaldéhyde dans un tampon approprié comme tbs/SCT ou PBS minerai optimal. Ceci est chimiquement défini contrairement aux préparations formalines utilisées pour l’histologie standard, et induit moins d’autofluorescence tissulaire. En revanche, le tissu humain n’est souvent pas fixé directement après l’excision, et comme fixatif, normalement une dilution de 10% de formaline est utilisée qui contient 10% à 15% de méthanol comme stabilisateur pour empêcher la polymérisation, ainsi que l’acide formique, d’autres aldéhydes, et les cétones . Souvent, le tissu est stocké dans ce fixatif pendant de longues quantités de temps avant l’intégration. Le résultat peut être l’autolyse (selon le temps entre l’excision et la fixation), et la formation excessive de ponts de méthylène en raison de la surfixation. La fixation du formaldéhyde induit des changements dans la structure tertiaire des protéines par la formation de ponts méthylène séthylène intra- et intermoléculaires10. Les composants cellulaires non protéiniques comme les acides nucléiques, les glucides et les lipides ne sont pas fixés directement, mais immobilisés dans le réseau tridimensionnel de protéines. Pour réussir l’étiquetage, les liaisons de méthylène doivent être brisées pour exposer les épitopes dans le processus de récupération d’antigène. Ceci est accompli en chauffant des sections de tissu montées sur des glissières de microscope dans un tampon de récupération d’antigène induit par la chaleur approprié (tampon d’HIER)11. Notre étude précédente a analysé l’influence du pH et de la température des tampons HIER sur la détection des composants NET dans les tissus paraffinés, et il a été constaté que le prétraitement réussi des tissus pour un composant est souvent sous-optimal pour un deuxième composant8.
Dans l’intervalle, il a été constaté que le chauffage du tissu à 70 oC dans le tampon HIER à un pH de 9 est un bon compromis pour de nombreux composants NET et conservera une bonne conservation des tissus, qui est souvent compromise à des températures plus élevées. Il est proposé d’utiliser le temps de récupération indiqué comme point de départ, mais surtout avec des spécimens d’archives de paramètres de fixation inconnus, l’intensité de coloration peut être insatisfaisante. Dans ce cas, la prolongation ou une température plus élevée pendant la procédure de récupération peut améliorer l’efficacité de coloration. Cela peut également influencer la coloration histone 2B de l’anticorps IgY utilisé dans notre protocole. Comme le montre la figure 1, la chromatine décondensée se trouve dans les neutrophiles subissant la NETosis ainsi que dans les taches NETs beaucoup plus fortes avec cet anticorps par rapport à la chromatine dans les neutrophiles au repos. Ceci est probablement dû à l’accès restreint de la molécule IgY 180 kDa aux noyaux compacts et peut différer après une récupération accrue de l’épitope. Ceci peut intensifier l’efficacité de liaison même dans les secteurs de la chromatine condensée, qui aura comme conséquence la fluorescence plus forte dans les noyaux normaux des neutrophiles et d’autres cellules. La différence d’efficacité de coloration entre les neutrophiles subissant la NETosis et les neutrophiles non stimulés pourrait être moins prononcée que celle décrite dans la figure 1. Les zones de formation de l’EI seraient encore identifiées par la co-localisation de l’EN, du H2B et de l’ADN.
La procédure de fixation peut également induire l’autofluorescence significative du tissu, principalement dans la partie bleuâtre/verdâtre du spectre. Il est important d’éviter la majeure partie de cette autofluorescence en utilisant des ensembles de filtres à fluorescence à bande étroite adéquats (champ large) ou des paramètres de détecteur (confocal) qui correspondent au maximum d’émission du fluorochrome utilisé avec l’excitation bleue, par exemple, Cy2, Alexafluor 488. Dans les cas extrêmes d’autofluorescence, la partie bleutée/verdâtre du spectre doit être évitée. Au lieu de cela, les signaux de fluorescence peuvent être détectés plus facilement dans la partie rouge du spectre (par exemple, les anticorps secondaires couplés à Cy 5 ou Alexafluor 635), mais cela nécessite des caméras noires/blanches sans filtre ou des microscopes confocals. Puisque l’œil humain est plutôt insensible au-delà de 600 nm, les signaux de fluorescence rouge lointain peuvent difficilement être détectés à l’aide d’oculaires. Dans tous les cas, il est important d’utiliser des contrôles négatifs (p. ex., des contrôles non immunisés sur le sérum/isotype au lieu d’anticorps primaires ou de l’omission d’anticorps primaires) pour déterminer les temps d’exposition appropriés ou les paramètres du détecteur.
Les sections de tissus d’une vingtaine de m peuvent être analysées à l’aide de microscopes à large champ à l’aide d’objectifs 10x ou 20x. Ces lentilles fournissent une grande profondeur focale, de sorte (presque) toute la section des tissus seront au point. Cela peut être utilisé pour scanner rapidement les sections de tissus pour les zones de formation NET si elles sont suffisamment grandes (comme à la figure 1). La colocalisation des canaux vert (NE), rouge (H2B) et bleu (ADN) donne lieu à une coloration blanche indiquant les zones de formation de l’EI (Figure 1G). Pour des grossissements plus élevés, des microscopes confocals ou à large champ avec déconvolution sont nécessaires. La figure 2 montre les détails du spécimen d’appendicite humaine également utilisé pour la figure 1. Dans la figure 2A, ne se localise en petits points (granules), mais une grande proportion est extracellulaire, formant souvent des bandes qui chevauchent h2B (figure 2B) et l’ADN (Figure 2C). Cette colocalisation donne lieu à une pari blanchâtre indiquant les ENE (figure 2D). Un modèle très similaire peut être trouvé dans la section pulmonaire d’une souris infectée par M. tuberculosis (Figure 3).
Les spécimens présentés ici sont caractérisés par des zones avec un degré élevé de formation NET qui peuvent être identifiés même à faible grossissement. Selon la densité des tissus et le stimulus respectif, la formation net peut être beaucoup moins prononcée, jusqu’à la formation NET de petits groupes de neutrophiles (par exemple dans la myocardite, voir une publication précédente12). On croit que ce protocole aidera à favoriser plus de recherche sur les TNE dans les tissus et, espérons-le, à démêler les rôles non reconnus des EDR dans la formation ou la prévention des maladies.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs n’ont rien à révéler.
bovine serum albumine | Sigma | A7906 | |
chicken anti Histone 2B antibody | Abcam | ab 134211 | |
cold water fish gelatine | Sigma-Aldrich | G7765 | |
donkey anti chicken antibody, Cy3 conjugated, for multiple labelling | Jackson Immuno Research | 703-165-155 | |
donkey anti rabbit antibody, Cy2 conjugated, for multiple labelling | Jackson Immuno Research | 711-225-152 | alternatively Cy5 conjugate, 711-175-152 |
embedding cassettes | Roth | K116.1 | |
embedding molds | Sakura | 4162 | |
embedding station | Microm | AP280 | |
ethanol | Roth | 9065.4 | |
filter paper, rolled | OCB | ||
forceps | Dumont | 7a | |
glass cylinder with 20 cm diameter | VWR | 216-0075 | |
glycerol | Roth | 3783.1 | |
HIER buffer pH 9 | Scytek | TES999 | |
Hoechst 33342 | Sigma | 14533 | |
incubator (dry, up to 40 °C) | Memmert | MMIPP30 | |
moist chamber (plastic box with tight lid) | Emsa | 508542 | |
Mowiol 40-88 | Aldrich | 32.459-0 | |
normal donkey serum | Merck | S30 | |
PAP-pen ImmEdge | Vector Lab | H-4000 | |
paraffin microtome | Microm | 355S | water bath included |
paraformaldehyde | Aldrich | 16005 | |
petri dishes | Schubert /Weiss | 7020051 | |
rabbit anti ELANE antibody | Atlas | HPA068836 | |
racks, jars for microscope slides | Roth | H554.1 H552.1 | |
scalpel | Braun | Fig.22 | |
Superfrost Plus glass slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
temperature-controlled hot plate | NeoLab | D6010 | |
tissue processor for paraffin embedding | Leica | TP1020 | |
Tris buffered saline TBS | VWR | 788 | |
Triton X100 | Roth | 3051.4 | |
Tween 20 | Fluka | 93773 | |
water bath 37 °C | GFL | 1052 | |
widefield or confocal microscope | Leica | DMR, SP8 | |
xylene (dimethylbenzene) | Roth | 9713.3 |