Summary
Här presenterar vi ett immunohistokemi testprotokoll för påvisande av rabies virus antigen som ett alternativt diagnostiskt test för formalin-fasta vävnader.
Abstract
En av de primära diagnostiska metoderna för rabies är påvisande av viral ribonukleoprotein (RNP) komplexa (antigen) i de infekterade vävnadsproverna. Medan det direkta fluorescerande antikroppstestet (DFA) eller det direkta snabba immunohistokemiska testet (DRIT) oftast används för antigendetektion, kräver båda testerna färska och/eller frysta vävnader för intryck på diabilder före antigendetektionen med antikroppar. Om prover samlas in och fixeras i formalin är inget av testerna optimalt för antigendetektion, men testning kan utföras av konventionell immunohistokemi (IHC) efter inbäddning i paraffinblock och sektionering. Med denna IHC-metod färgas vävnader med anti-rabies antikroppar, avsnitt är deparaffiniserade, antigen hämtas genom partiell proteolys eller andra metoder och inkuberas med primära och sekundära antikroppar. Antigener färgas med pepparrot peroxidas / amino etylkarbazol och kontrastained med hematoxylin för visualisering med hjälp av ett lätt mikroskop. Utöver den specifika antigendetektion erbjuder formalinfixering andra fördelar som bestämning av histologiska förändringar, avslappnade förhållanden för lagring och transport av prover (under omgivningstemperatur), förmåga att testa retrospektiva fall och förbättrad biologisk säkerhet genom inaktivering av smittämnen.
Introduction
Rabies är en akut progressiv encefalit orsakad av den negativa känslan RNA-virus som tillhör släktet lyssavirus1. Nästan 99% av alla mänskliga dödsfall orsakade av infektionen med rabiesvirus (RABV), typmedlemmen av släktet, överförs av hundar2. Rabies diagnos av misstänkta djur förlitar sig på påvisande av antigen (främst viral kodade nukleoprotein, N protein) i komplex med genomisk RNA (ribonukleoprotein komplex, RNP) ihjärnvävnaden 3. Antigen detektion av direkt fluorescerande antikroppar (DFA) test anses vara guld standard för rabies diagnos4. Metoden använder färskt eller färskt fruset hjärnmaterial, ett beröringsintryck på en glidning, fixering i aceton, färgning med kommersiellt tillgängligt fluorescerande isothiocyanat (FITC) märkt monoklonal eller polyklonal antikropp (mAbs/ pAbs) och läst av fluorescensmikroskopi5. DFA-testet är snabbt, känsligt och specifikt för rabiesantigendetektering i färsk hjärnvävnad. Nyligen visades ett direkt snabbt immunohistokemiskt test (DRIT), modifierad immunohistokemi (IHC) teknik, uppvisa liknande känslighet som DFA men erbjuder fördelen med ljusmikroskopi för visualisering6. Medan detektionsmetoden som används i DRIT liknar IHC, använder det första steget färska eller frysta vävnader för att generera beröringsintryck av provet följt av fixering i formalin.
IHC är en allmänt använd teknik för att bestämma histologiska förändringar och detektion av proteiner med hjälp av specifika antikroppar i formalin-fasta vävnader inbäddade i paraffinblock. IHC är ett fastställt alternativt test för rabiesantigendetektion i vävnadssektionerna7. IHC har använts särskilt för diagnos av retrospektiva fall som uppvisade neurologiska sjukdomar för att bestämma bördan av rabies8. Paraffin-inbäddade formalin-fasta vävnader bevarar proteinerna för detektion även efter flera år när de lagras vid omgivningstemperatur9. Formalinbehandling ändrar proteiner genom att korslänka och ändra aminosyran sidokedjor, vilket kan göra epitoperna inte längre reaktiva mot antikroppar10. Medan IHC-testet för rabies antigen detektion involverar antingen mAbs eller pAbs, den senare är fördelaktig eftersom flera epitoper och divergerande lyssavirus kan detekteras11.
De standardsteg som är involverade i IHC är formalin fixering av vävnader, inbäddning i paraffinblock, sektionering av vävnader, deparaffinisering och hydrering, epitopåterhämtning, reaktivitet mot primära och sekundära antikroppar och utveckling med kromogena substrat. Detta manuskript beskriver en detaljerad redogörelse för protokollet för rabies diagnos. För rabies antigen detektion, mus serum immuniseras med RABV (pAbs) genereras vid U.S. Centers for Disease Control and Prevention (CDC) Atlanta, Georgia, i kombination med biotinylerade anti-mouse sekundära antikroppar används. Biotinylerade abs detekteras genom tillsats av streptavidin-pepparrot peroxidas (HRP) komplex följt av färgutvecklingen med amino-etylkarbazol substrat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Medan IHC-protokollet utfördes på formalin-fasta vävnader, som inaktiverar RABV om det finns, bör lämpliga biosäkerhetsprotokoll följas korrekt. Alla biosäkerhetsförfaranden beskrivs i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) 5th Edition (https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm), inklusive att bära korrekt personlig skyddsutrustning (PPE) och vaccinationskrav enligtbeskrivningen 12. Dessutom bör korrekt inneslutning och hantering av farliga kemikalier (som formalin, AEC och xylen) följas (t.ex. rökhuvar).
1. Formalinfixering av vävnader
- Placera 3-5 mm hjärnvävnader som samlats in efter obduktion13 i 10% fosfat buffrad formalinlösning (1:20 till 1:50 vävnad/formalinförhållande) i 24-72 h.
VARNING: Formalin är ett giftigt fixativ. - Registrera den ungefärliga vävnadsvikten (storlek), vävnadstyp (hjärnområden) och volymen formalin. Det är viktigt för laboratorier att dokumentera och föra register över fixeringstider.
- För längre vävnadslagring efter formalinfixering och före bearbetning, placera vävnaden i 70% etanol.
2. Vävnadsbehandling
- Efter provfixeringen, dissekera vävnaden för att inkludera de viktiga hjärnområdena, t.ex. tvärsnitt av hjärnstammen, lillhjärnan (3 lober) eller hippocampus (båda hippocampi) var och en skuren 3 till 5 mm tjock och placerad i bearbetningskassetter.
- Bearbeta vävnadskassetterna för paraffinvaxinfiltration, inbäddade i paraffinblock och sektionerade (3 till 6 μm) på en mikrotom.
3. Beredning av material / Färgningsrätter
- Ställ in färgningsformen14 (Materialförteckningen) enligt figur 1. Fyll varje maträtt med 250 ml lösning.
- Beredning av substratbeståndslösningen 3-Amino-9-etylkarbizol (AEC)
- Lös upp en 20 mg tablett 3-amino 9-etylkarbazol (AEC) i 5 ml N,N, dimetylformamid med en glaspipett.
VARNING: AEC är cancerframkallande.
- Lös upp en 20 mg tablett 3-amino 9-etylkarbazol (AEC) i 5 ml N,N, dimetylformamid med en glaspipett.
- Beredning av proteas (t.ex. Pronase) stamlösning för antigenhämtning
- Lös upp 7 mg proteas i 200 ml PBS.
- Beredning av sköljbufferten PBS-T
- Tillsätt 10 ml interpoleringsknappar på 80 till 990 ml PBS. Blanda det väl för att bilda en homogen lösning.
4. Deparaffinisering och vävnadsrehydrering
- Gör 5 μm paraffinsektion med hjälp av en mikrotom, flyta den på ett vattenbad vid 38 °C och samla på glasrutschbanor. Märk bilderna med en reagensbeständig penna/markör.
- Placera diabilderna på en bricka och smält i en 55-60 °C ugn i 1 timme. Höj inte temperaturen över 60 °C eftersom det kan förstöra virusantigenet.
- Ta bort diabilder från ugnen och avparaffinisera omedelbart i 3 på varandra följande xylensköljningar på 5 minuter vardera i disken 1, 2 och 3.
- Återfukta sektionerna på diabilden genom sekventiella nedsänkningar vid minskande utspädning av etanol till avjoniserat vatten: (4 till 11 är en doppsköljning) skål 4: xylen/100% etanol (1:1); maträtt 5: 100% etanol; maträtt 6: 100% etanol; maträtt 7: 95% etanol; maträtt 8: 95% etanol; maträtt 9: 80% etanol; maträtt 10: 70% etanol; Skål 11: avjoniserat vatten (Figur 1. Diskinrättning).
VARNING: Xylen är en farlig kemikalie och arbete bör utföras i en rökhuv.
5. Proteolytisk antigenhämtning
- Behandla diabilder med proteas (2,5 μg/ml PBS) i 30 minuter för proteolytisk antigenhämtning i skål 12.
- Skölj sedan i PBS-T i 10 min (skål 13).
- Behandla med 3% väteperoxid i 10 min (skål 14).
- Återigen, tvätta med PBS-T i 10 min (skål 15).
6. Färgningsprocedur
- Hantera bilder en i taget och håll de återstående bilderna nedsänkta i bufferten (ta inte bort hela bildhållaren - håll bilderna våta). Ta bort en rutschkana och fläcka av överskottsbufferten (med en pappershandduk) från runt vävnadsdelen och var noga med att inte störa vävnadsdelen. Inkubera diabilder i en fuktighetskammare, gjord genom att placera fuktade pappershanddukar, pålabbbänkens topp 14 vid rumstemperatur med normalt getserum (blockering) i 15 minuter.
- Inkubera med optimal förbestämd utspädning primär antirabbiesantikropp (1:250 utspädning av mus antirabbieserum, opublicerad) (positiv kontroll) och negativa kontrollantikroppar vid rumstemperatur som ovan (steg 6.1.) i 60 min utan tvättar däremellan.
- Efter 60 min, tvätta med PBS-T i 10 min (skål 16).
- Inkubera med den biotinylerade antikroppen (specifik art) i en fuktighetskammare vid rumstemperatur i 15 minuter (hantering samma som steg 6.1).
- Tvätta med PBS-T i 10 min (skål 16).
- Inkubera med Streptavidin-HRP-komplex i en fuktighetskammare vid rumstemperatur i 15 min (hantering samma som 6.1.).
- Tvätta med PBS-T i 10 min (skål 16).
- Inkubera med peroxidassubstrat, aminoetylkarbazol (AEC), i en fuktighetskammare vid rumstemperatur i 10 min. Gör AEC precis före användning. För att göra det, tillsätt 1 ml AEC-stamlösning till 14 ml 0,1 M acetatbuffert, pH 5,2. Tillsätt 0,15 ml 3% H2O2. Filtrera blandningen strax före användning (0,45 μm filter).
OBS: Arbetslösningen för AEC är endast stabil i 2-3 timmar. AEC-stamlösningen kan förvaras i kylskåp under längre perioder. - Tvätta i avjoniserat vatten 10 min (skål 17)
- Motarbetad med Gills Hematoxylin utspädd 1:2 med avjoniserat vatten i 2 min (maträtt 18).
- Skölj av överflödig Hematoxylin med avjoniserad vattendippsköljning (skål 19 och 20).
- Skölj i Scott's Tap water 30 s (bluing solution) skål 21.
- Tvätta i avjoniserat vatten 10 min (skål 22)
- Ta bort diabilderna en i taget - montera med vattenlösligt monteringsmedium.
- Läs bilder på ett ljusmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 visar representativa IHC-färgningsresultat av positiva och negativa kontrollprover i olika testade hjärnvävnader. Figur 2A,D,G representerar positiva prover vid 200x, medan figur 2B,E,H motsvarar 400x förstoring. Figur 2A-C motsvarar hjärnstammen; Figur 2D-F motsvarar cellerna cerebellum och Purkinje. och figur 2G-I motsvarar hippocampus. Figur 2C, F, jag är negativa kontrollprover. Magenta röd färgning visar färgutveckling med AEC substrat i den blå bakgrunden (Hematoxylin motstå) på grund av reaktivitet av antikroppar mot rabies antigen. AEC är ett peroxidassubstrat, som vid oxidationsreaktion, katalyserat av HRP, resulterar i vattenlösligt fällningsbart under ett ljusmikroskop.
Ett positivt resultat i IHC motsvarar magenta röd färgning i vävnad avsnitt. Färgning av cytoplasmic införanden och granulat införanden av varierande storlek är vägledande för prover positiva för RABV infektioner. Proverna anses vara negativa om ingen specifik röd färgning eller endast den blå bakgrunden på grund av hematoxylin observerades. Förutom den positiva färgningen kan fördelningen av inneslutningar ge indirekt kvantifiering av nivåerna av rabiesantigen i provet, vilket kan motsvara vävnadsprovernas virusbelastning. Oavsett distributionsnivåer kommer varje specifik färgning att klassificera provet som positivt för rabv-antigendetektering.
Figur 1: Flödesschema som anger olika steg för IHC-testning. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Immunohistokemisk färgning av positiv och negativ rabies hjärnvävnad. a)Intracytoplasmiska virusinkluderingar och rabiesvirusantigendetektering i hjärnstammen 200x total förstoring. B)Positiv hjärnstammen 400x; C)Hjärnstammen negativ kontroll 200x; D)Rabiesvirusinkluderingar i lillhjärnan 200x. E)Cerebellum- och Purkinjecellerna 400x. F)Negativ kontroll av lillhjärnan. G)Virala inneslutningar i hippocampus 200x. H)Hippocampus 400x. hippocampus negativ kontroll 200x. Den röda fläcken indikerar förekomsten av rabiesvirusantigen med hjälp av Streptavidin-biotin komplexa färgning metod (AEC substrat). Hematoxylin motstå (blå). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grund av den höga dödstalen av rabies efter symptomet insättande, diagnos av misstänkta djur för RABV infektion är extremt avgörande för en lämplig post-exposure profylaktisk behandling. Rabies diagnos beror främst på DFA, DRIT och PCR-baserade tekniker med färska eller frysta vävnader. För testning av formalin-fasta vävnader ger IHC-testet en alternativ metod för känslig och specifik detektion av RABV-antigen. Medan de vävnader som är fixerade i formalin har proteiner stabiliserade på grund av modifiering av sidokedjor som korslänkning, måste proverna bearbetas före antigendetektionen. I detta protokoll återfanns epitoperna genom partiell proteolytisk matsmältning av proteas (t.ex. Pronase) för att möjliggöra bindning av primära antikroppar till RNP-komplexet. Medan mAbs reaktiva mot N-protein främst förlitar sig på I DFA och DRIT, skulle pAbs som är reaktiva mot flera epitoper på N-protein föredras för ett IHC-test. Dessutom kan reaktiviteten eller pAbs vara bredare mot olika RABV-varianter och mot icke-rabies lyssavirus jämfört med mAbs.
En av de största begränsningarna i IHC-testet är att protokollet involverar flera sekventiella steg och tar cirka 6 timmar för slutförande. Om vävnaden behöver fixeras i formalin och bäddas in i paraffinblock, kräver det ytterligare 1- 2 dagar innan vävnaden kan färgas. En annan begränsning är att kommersiella primära antirabbiesantikroppar inte finns tillgängliga för IHC-testet. IHC ger dock ett alternativ att utföra rabiesdiagnos när endast FF-vävnader är tillgängliga för testning. IHC-testet är särskilt viktigt för testning av rabiesfall om hälften av vävnaderna lagras i formalin (och andra unfixed vävnader som testats av DFA) och det var nödvändigt att testa hela tvärsnittet av hjärnstammen och andra vävnader, efter behov för diagnos. Rabies antigen detektion genom IHC-test kan användas för mänskliga post-mortem hjärnprover för diagnos och / eller retrospektiv analys av misstänkta fall baserat på de kliniska symptomen. Medan IHC inte godkändes som ett primärt eller bekräftande test för rabiesdiagnos, som DFA, detekterar metoden antigen med rabiesspecifika antikroppar. Jämförelse av DFA med färska/frysta vs FF vävnader gav liknande känslighet och specificitet15. Om inte antikropparna är direkt konjugerade till FITC (kravet på DFA-test) kan HRP-märkta antikroppar användas i IHC för färgning av rabiesantigen. Fördelen med HRP-baserad detektion är förmågan att använda ett ljusmikroskop för observationen. De nuvarande kommersiellt tillgängliga DFA-reagenserna, FITC konjugerade rabiesspecifika antikroppar (mAbs) påvisar inte antigen efter formalinfixering på grund av modifiering av epitoper. Men om FITC konjugerade rabies specifika pAbs finns tillgängliga, kan det användas som en färgningsmetod, som rekommenderas av Världshälsoorganisationen16. Förutom antigendetektering kan FF-vävnader utsättas för RNA-isolering följt av PCR och sekvensering med hjälp av specifika primers för att bekräfta förekomsten av RABV genomiskt RNA.
De andra fördelarna med formalin-fasta vävnader inkluderar bestämning av histologiska förändringar med hematoxylin och eosin färgning metod. Medan formalinbehandlingen bevarar protein inaktiverar den helt de flesta patogener i provet på grund av den omfattande korskopplingen av proteiner och nedbrytning eller modifiering av nukleinsyror. Metoden förbättrar således säkerheten för biologisk provhantering, frakt och testning jämfört med DFA. Acetonfixeringssteget i DFA inaktiverar inte RABV och bör hanteras med lämplig PPE17. Proverna efter formalinfixering är stabila och kan förvaras vid omgivningstemperatur, vilket lämpar sig för områden med låg resurs där tillgången till kylförvaring är begränsad. På samma sätt kan paraffin-inbäddade formalin-fasta vävnader övervägas för långtidslagring vid omgivningstemperaturer utan att förlora antikropps reaktivitet mot proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar arbetarna, epidemiologerna och dotterbolagen till folkhälsoavdelningar för provinlämningar till Centers for Disease Control and Prevention. Resultaten och slutsatserna i denna rapport är författarnas och representerar inte nödvändigtvis den officiella positionen för Centers for Disease Control and Prevention. Användning av handelsnamn och kommersiella källor är endast för identifiering och innebär inte godkännande av Centers for Disease Control and Prevention.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% hydrogen peroxide | Pharamacy brands | Off the shelf 3% H2O2 | |
| 3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC) | Millipore Sigma | A6926 | |
| Acetate Buffer pH 5.2 | Poly Scientific R&D Corp. | s140 | |
| Buffered Formalin 10% Phosphate Buffered | Fisher Scientific | SF100-4 | Certified |
| Cover slips Corning | Fisher Scientific | 12-553-471 | 24 X 50 mm |
| Ethanol 190 Proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol 200 Proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Gill's hematoxylin formulation #2 | Fisher Scientific | CS401-1D | |
| HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kit | seracare | 71-00-18 | Mouse Primary Antibody |
| ImmunoHistoMount | Millipore Sigma | i1161 | Mounting media |
| N,N, Dimethyl formamide GR | Fisher Scientific | D119 | |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | RR14440.01 | 01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6) |
| Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Objective | Multiple vendors | ||
| Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objective | Multiple vendors | ||
| Pronase | Millipore Sigma | 53702 | Protease, Streptomyces griseus |
| Scott's Tap Water | Poly Scientific R&D Corp. | s1887 | |
| Tissue-Tek Slide stain set | Fisher Scientific | 50-294-72 | |
| TWEEN-80 | Millipore Sigma | P1754 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3S-4 | Histological Grade |
| Zeiss Axioplan 2 imaging - microscope | Multiple vendors |
References
- Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies. F1000Research. 6, 184 (2017).
- Fooks, A. R., et al. Current status of rabies and prospects for elimination. Lancet. 384 (9951), 1389-1399 (2014).
- Finke, S., Brzozka, K., Conzelmann, K. K. Tracking fluorescence-labeled rabies virus: enhanced green fluorescent protein-tagged phosphoprotein P supports virus gene expression and formation of infectious particles. Journal of Virology. 78 (22), 12333-12343 (2004).
- WHO. WHO Expert Consulation on Rabies, Third Report. WHO Technical Report Series. 1012, 1 (2018).
- Goldwasser, R. A., Kissling, R. E. Fluorescent antibody staining of street and fixed rabies virus antigens. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 98 (2), 219-223 (1958).
- Lembo, T., et al. Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis. Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).
- Fekadu, M., Greer, P. W., Chandler, F. W., Sanderlin, D. W. Use of the avidin-biotin peroxidase system to detect rabies antigen in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Journal of Virological Methods. 19 (2), 91-96 (1988).
- Hamir, A. N., Moser, G., Rupprecht, C. E. A five year (1985-1989) retrospective study of equine neurological diseases with special reference to rabies. Journal of Comparative Pathology. 106 (4), 411-421 (1992).
- Inoue, S., et al. Cross-reactive antigenicity of nucleoproteins of lyssaviruses recognized by a monospecific antirabies virus nucleoprotein antiserum on paraffin sections of formalin-fixed tissues. Pathology International. 53 (8), 525-533 (2003).
- Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
- Feiden, W., et al. Immunohistochemical staining of rabies virus antigen with monoclonal and polyclonal antibodies in paraffin tissue sections. Zentralblatt fur Veterinarmedizin Reihe B. 35 (4), 247-255 (1988).
- Manning, S. E., et al. Human rabies prevention--United States, 2008: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices. Morbidity and Mortality Weekly Reports Recommendations and Reports. 57, 1-28 (2008).
- WHO. Laboratory techniques in rabies. 1, 5th ed, 67-72 (2018).
- Patrick, E. M., et al. Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
- Whitfield, S. G., et al. A comparative study of the fluorescent antibody test for rabies diagnosis in fresh and formalin-fixed brain tissue specimens. Journal of Virology Methods. 95 (1-2), 145-151 (2001).
- WHO. Diagnostic procedures for antigen detection. , https://www.who.int/rabies/about/antigendetection/en (2016).
- Jarvis, J. A., Franke, M. A., Davis, A. D. Rabies direct fluorescent antibody test does not inactivate rabies or eastern equine encephalitis viruses. Journal of Virology Methods. 234, 52-53 (2016).
