Generation af chimeric Axolotls med Mutant Haploid Lemmer gennem embryonale podning
Summary
Dette mål med denne protokol er at producere kimære axolotls med haploid forelimbs stammer fra Cas9-muttageniseret donorvæv ved hjælp af embryonale væv podning teknikker.
Abstract
Et voksende sæt af genetiske teknikker og ressourcer gør det muligt for forskere at sonde den molekylære oprindelse af evnen af nogle arter af salamandere, såsom axolotls, at regenerere hele lemmer som voksne. Her skitserer vi teknikker, der anvendes til at generere kimære axolotls med Cas9-muttagenized haploid forlemmer, der kan bruges til at udforske genfunktion og troskab lemmer regenerering. Vi kombinerer flere embryologiske og genetiske teknikker, herunder haploid generation via in vitro aktivering, CRISPR/Cas9 mutagenese, og væv podning i en protokol til at producere et unikt system til haploid genetisk screening i en model organisme af regenerering. Denne strategi reducerer antallet af dyr, rum og tid, der kræves til funktionel analyse af gener i lemmer regenerering. Dette gør det også muligt at undersøge regenereringsspecifikke funktioner af gener, der kan være nødvendige for andre væsentlige processer, såsom organogenese, vævmorfosese, og andre væsentlige embryonale processer. Den metode, der er beskrevet her, er en unik platform til at gennemføre haploid genetisk screening i et hvirveldyr modelsystem.
Introduction
Historisk set har embryonale vævspodning i padder været en vigtig teknik til at udforske grundlæggende mekanismer for udviklingsbiologi og regenerering. Den axolotl, en art af salamander, besidder en imponerende evne til at regenerere væv og komplekse strukturer såsom lemmer og organer efter skade eller amputation. Tilsvarende imponerende, de kan modtage, uden afvisning, vævgrafts fra andre personer på embryonale, unge, og voksne stadier1,2,3. Regioner af embryoner, der producerer hele strukturer såsom lemmer, haler, øjne og hoveder, og mere specifikke væv, såsom neuroektoderm og somiter, kan podes mellem embryoner til at producere kimære dyr1,2,4,5,6. I næsten et århundrede har undersøgelser af sådanne kimære dyr givet afgørende indsigt i regenerering, vævsdifferentiering, størrelseskontrol ogmønstre1,7,8.
I det sidste årti har talrige transskriptionelle undersøgelser af regenererende væv givet indsigt i de genetiske programmer, der ligger til grund for salamanderregenerering9,10,11,12,13. Disse undersøgelser har føjet til en voksende liste over kandidat gener, der til dato er stort set ukarakteriseret i forbindelse med regenerering. Målrettede mutagenese teknikker, såsom CRISPR / Cas, nu tillader undersøgelse af sådanne gener, og sådanne genetiske tilgange er stærkt lettet af den seneste sekventering og samling af den store axolotl genom14,15,16.
Vi forsøgte at udvikle teknikker, der koblede klassisk udviklingsbiologi sammen med ny genetisk teknologi med henblik på at dissekere regenereringsmekanismerne. Der er i årtier17etableret metoder til fremstilling af haploidembryoner af axolotls og andre salamandere . Mens disse teknikker længe har været bemærket at være fordele ved salamandere som genetiske model organismer18, få efterfølgende genetiske undersøgelser har indarbejdet haploid dyr. Vi bruger in vitro aktivering i axolotl til at producere haploid embryoner, der tjener som væv donorer til podning19. Ved hjælp af embryoner med fluorescerende genetiske markører har vi udviklet pålidelige metoder til at generere lemmer, der næsten udelukkende stammer fra donorvæv (figur 1A). Ved at kombinere disse to teknikker har vi omgået den sene embryonale dødelighed, der er forbundet med haploidy, hvilket giver mulighed for produktion af fuldt udviklede, podede haploidlemmer(figur 1B, figur 1B«og figur 2).
Ved at gennemføre CRISPR/Cas-medieret mutagenesis i haploid embryoner før podning for at skabe kimære axolotls med mutant haploid lemmer, kan vi undersøge genfunktion specifikt i forbindelse med lemmer udvikling og regenerering. Dette gør det muligt at redde lemmer fra potentielt embryonale-dødelige mutant fænotyper. Mens CRISPR / Cas mikroinjektion kan generere dyr, der er meget mutant, sådanne dyr er typisk meget mosaik, med en vis grad af fastholdelse af vilde arter alleler og en række forskellige mutationer på målrettede steder14,20. CRISPR-baserede mutagenese i haploidceller øger penetrance af enkelt allel tab af funktion mutationer, da de ikke kan maskeres af bevarede vilde type alleler. Derfor anvendes CRISPR-baseret screening i haploidcellelinjer i stigende grad til at undersøge det genetiske grundlag for mange cellulære processer21,22,23. Ved at kombinere CRISPR-baserede afstamning sporing med vores haploid lemmer knop podning protokoller, den tilgang, der er beskrevet her kan tjene som en platform for haploid genetiske skærme i levende dyr20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der er et par kritiske trin i vores protokol til generering haploid-diploid kimærer, at driftsteknikeren bør overveje for konsekvent podning resultater.
Den mest sandsynlige årsag til haploid generation til at mislykkes skyldes dårlig in vitro aktivering betingelser. De korrekte mængder motilesæd skal anvendes til at aktivere æg. For at forlænge motiliteten bør sædprøver altid opbevares ved 4 °C. Før du anvender en sædprøve på æg, skal du kontrollere sædcellernes levedygtighe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Katherine Roberts for hendes pleje af axolotl kolonien. Finansieringen af dette arbejde blev ydet af Connecticut Innovations Regenerativ Medicine Research Fund (15RMA-YALE-09 og 15-RMB-YALE-01) og Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (Individuelle Postdoctoral Fællesskab F32HD086942).
Materials
| #55 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11295-1 | Only use Dumostar material (can be autoclaved) |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942-20ML | 20 mL |
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Thermo Fisher | 15240062 | |
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850-5G-F | |
| Ficoll 400 (polysucrose 400) | bioworld | 40600032-3 | Ficoll 400 |
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1914-250MG | |
| Heating/Cooling Incubator | RevSci | RS-IF-233 | |
| Human Chorionic Gonadotropin | Merk | Chorulon | |
| Megascript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher | AM1334 | 40 reactions |
| Miroscope Cooling Stage | Brook Industries | Custom | Custom |
| NLS Cas9 Protein | PNAbio | CP01-200 | 4 vials of 50 µg protein each |
| Plasmocin | Invivogen | ant-mpt-1 | Treatment level |
| Recipes | |||
| 1.0x Marc's modified Ringer's solution (MMR) | 0.1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0.1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7.8), ph 7.4 | ||
| 40% Holtfreter's solution | 20 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM NaHCO3, 0.2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH to 7.4 |
References
- Kragl, M., et al. Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration. Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).
- Maden, M., Goodwin, B. C. Experiments on developing limb buds of the axolotl Ambystoma mexicanum. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 57, 177-187 (1980).
- McCusker, C. D., Diaz-Castillo, C., Sosnik, J., Phan, A. Q., Gardiner, D. M. Cartilage and bone cells do not participate in skeletal regeneration in Ambystoma mexicanum limbs. Developmental Biology. 416 (1), 26-33 (2016).
- Brun, R. B. Experimental analysis of the eyeless mutant in the mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Integrative and Comparative Biology. 18 (2), 273-279 (1978).
- Lopez, D., et al. Mapping hematopoiesis in a fully regenerative vertebrate: the axolotl. Blood. 124 (8), 1232-1242 (2014).
- de Both, N. J. Transplantation of Axolotl Heads. Science. 162 (3852), 460-461 (1968).
- Harrison, R. G. Some Unexpected Results of the Heteroplastic Transplantation of Limbs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 10 (2), 69-74 (2006).
- Fields, E., French, V., Bryant, P. J., Bryant, S. V Pattern regulation in epimorphic fields. Science. 193 (4257), 969-981 (2013).
- Gerber, T., et al. Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration. Science. 362 (6413), (2018).
- Knapp, D., et al. Comparative transcriptional profiling of the axolotl limb identifies a tripartite regeneration-specific gene program. PloS One. 8 (5), e61352 (2013).
- Campbell, L. J., et al. Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 240 (7), 1826-1840 (2011).
- Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
- Gardiner, D. M., et al. Gene expression during the first 28 days of axolotl limb regeneration I: Experimental design and global analysis of gene expression. Regeneration. 2 (3), 120-136 (2015).
- Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).
- Smith, J. J., et al. A Chromosome-Scale Assembly of the Enormous (32 Gb) Axolotl Genome. bioRxiv. , 373548 (2018).
- Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 559 (7712), 50-55 (2018).
- Fankhauser, B. Y. G. The Effects of Changes in Chromosome Number on Amphibian Development. The Quarterly Review of Biology. 20 (1), 20-78 (1945).
- Malacinski, G. M., Brothers, A. J. Mutant Genes in the Mexican Axolotl. Science. 184 (4142), 1142-1147 (1974).
- Armstrong, B. Gynogenesis in the mexican axolotl. Genetics. 83 (4), 783-792 (1976).
- Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, 1-15 (2017).
- Shalem, O., et al. Genome – scale CRISPR – Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic Screens in Human Cells Using the CRISPR-Cas9 System. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
- Yin, Z., Chen, L. Simple Meets Single: The Application of. CRISPR/Cas9 in Haploid Embryonic Stem Cells. Stem Cells International. 2017, 1-6 (2017).
- Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).
- Vachon, P., Zullian, C., Dodelet-Devillers, A., Roy, S. Evaluation of the anesthetic effects of MS222 in the adult Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Veterinary Medicine: Research and Reports. 7, 1-7 (2016).
- Montague, T. G., et al. Efficient Mutagenesis by Cas9 Protein-Mediated Oligonucleotide Insertion and Large-Scale Assessment of Single-Guide RNAs. PLoS One. 9 (5), (2014).
- Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
- Kumar, A., Simon, A. . Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. , (2015).
- Hronowski, L., Gillespie, L. L., Armstrong, J. B. Development and Survival of Haploids of the Mexican Axolotl, Ambystoma mexicanum. Journal of Experimental Zoology. 209, 41-47 (1979).
- Schreckenberg, G. M., Jacobson, A. G. Normal stages of development of the axolotl, Ambystoma mexicanum. Developmental Biology. 42 (2), 391-399 (1975).
- Hertwig, G. Beitrage Zum Determinations- Und Regenerationsproblem Mittels Der Transplantation Haploidkerniger Zellen. Archiv f. Entwicklungsmechanik. 111, 292-316 (1927).
- Fei, J. -. F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).
