Summary
Este objetivo deste protocolo é produzir axolotos quiméricos com membros dianteiros haploides derivados de tecido doador mutagenizado de Cas9 usando técnicas de enxerto de tecido embrionário.
Abstract
Um conjunto crescente de técnicas e recursos genéticos permite aos pesquisadores sondar as origens moleculares da capacidade de algumas espécies de salamandras, como axolotlas, de regenerar membros inteiros como adultos. Aqui, delineamos técnicas usadas para gerar axolotas quiméricas com membros dianteiros haploides haploides mutagenizados cas9 que podem ser usados para explorar a função genética e a fidelidade da regeneração dos membros. Combinamos várias técnicas embrionárias e genéticas, incluindo geração haploide via ativação in vitro, mutagênese CRISPR/Cas9 e enxerto de tecido em um protocolo para produzir um sistema único para triagem genética haploide em um organismo modelo de regeneração. Essa estratégia reduz o número de animais, espaço e tempo necessários para a análise funcional dos genes na regeneração dos membros. Isso também permite a investigação de funções específicas de regeneração de genes que podem ser necessárias para outros processos essenciais, como organogênese, morfose tecidual e outros processos embrionários essenciais. O método descrito aqui é uma plataforma única para a realização de triagem genética haploide em um sistema de modelo vertebrado.
Introduction
Historicamente, o enxerto de tecido embrionário em anfíbios tem sido uma técnica importante para explorar mecanismos fundamentais de biologia e regeneração do desenvolvimento. O axolotl, uma espécie de salamandra, possui uma impressionante capacidade de regenerar tecidos e estruturas complexas, como membros e órgãos após lesões ou amputação. Da mesma forma impressionante, eles podem receber, sem rejeição, enxertos teciduais de outros indivíduos nos estágios embrionário, juvenil e adulto1,2,3. Regiões de embriões que produzem estruturas inteiras como membros, caudas, olhos e cabeças, e tecidos mais específicos, como neuroectoderme e somitas, podem ser enxertados entre embriões para produzir animais quiméricos1,2,4,5,6. Por quase um século, estudos desses animais quiméricos têm proporcionado insights cruciais sobre regeneração, diferenciação tecidual, controle de tamanho e padronização1,7,8.
Na última década, inúmeros estudos transcricionais de tecidos regeneradores produziram insights sobre os programas genéticos subjacentes à regeneração da salamandra9,10,11,12,13. Esses estudos se somaram a uma lista crescente de genes candidatos que, até o momento, são em grande parte descaracterizados no contexto da regeneração. Técnicas de mutagênese direcionadas, como crispr/cas, agora permitem a investigação de tais genes, e tais abordagens genéticas são muito facilitadas pelo sequenciamento recente e montagem do grande genoma axolotl14,15,16.
Buscamos desenvolver técnicas que acoplassem biologia clássica ao desenvolvimento com novas tecnologias genéticas com o objetivo de dissecar os mecanismos de regeneração. Métodos para gerar embriões haploides de axolotis e outros salamandras foram estabelecidos há décadas17. Embora essas técnicas tenham sido apontadas há muito tempo como vantagens dos salamandras como organismos modelo genéticos18, poucos estudos genéticos subsequentes incorporaram animais haploides. Usamos ativação in vitro no axolotl para produzir embriões haploides que servem como doadores de tecidos para enxerto19. Usando embriões que carregam marcadores genéticos fluorescentes, criamos métodos confiáveis para gerar membros derivados quase inteiramente de tecidos doadores(Figura 1A). Ao combinar essas duas técnicas, contornamos a letalidade embrionária tardia associada à haploide, permitindo a produção de membros heplóides totalmente desenvolvidos e enxertados(Figura1B, Figura 1Be Figura 2).
Ao conduzir a mutagênese mediada crispr/cas em embriões haploides antes do enxerto para criar axolotos quiméricos com membros haploides mutantes, podemos investigar a função genética especificamente dentro do contexto de desenvolvimento e regeneração dos membros. Isso permite o resgate de membros de fenótipos mutantes potencialmente embrionários-letais. Enquanto a microinjeção CRISPR/Cas pode gerar animais altamente mutantes, esses animais são tipicamente altamente mosaicos, com algum grau de retenção de alelos de tipo selvagem e uma variedade de mutações distintas em locais alvo14,20. A mutagênese à base de CRISPR em células haploides aumenta a penetração de mutações de perda de função de alelo único, pois não podem ser mascaradas por alelos do tipo selvagem retidos. Por essa razão, o rastreamento à base de CRISPR em linhas de células haploides é cada vez mais usado para investigar a base genética de muitos processos celulares21,22,23. Combinando rastreamento de linhagem à base de CRISPR com nossos protocolos de enxerto de bud alheio haploide, a abordagem descrita aqui pode servir como uma plataforma para telas genéticas haploides em animais vivos20.
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Protocol
Os procedimentos experimentais utilizados neste protocolo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Yale (IACUC, 2017-10557) e estavam de acordo com todas as políticas e diretrizes federais que regem o uso de animais vertebrados. Todos os experimentos em animais foram realizados em Ambystoma mexicanum (axolotls) em instalações da Universidade de Yale.
1. Geração de embriões diploidedos
- Obtenha embriões diploides GFP+ para servir como hospedeiros de enxerto através de acasalamento natural usando um ou dois pais gfp 24.
- Colete ovos diploides recém-colocados e coloque-os em uma peneira de metal.
- Enxágüe os ovos com 40% de solução de Holtfreter (20 mM NaCl, 0,2 mM KCl, 0,8 mM NaHCO3, 0,2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH a 7,4).
- Coloque os ovos em solução fresca de 40% holtfreter e armazene a 12 °C.
NOTA: Embriões diploides devem ser sempre obtidos antes de passar para a geração de embriões haploides.
2. Geração de embriões haploides
- Preparação de doadores de gamete feminino
- 48 h antes de realizar a ativação in vitro, anestesia um axolotl feminino branco ou branco/RFP sexualmente maduro por imersão em 1 g/L HEPES-buffered MS-222 em 40% solução Holtfreter25.
- Certifique-se de que o animal esteja totalmente anestesiado após aproximadamente 30 min de imersão, beliscando firmemente sua cauda entre o polegar e o dedo indicador. Animais totalmente anestesiados não responderão fisicamente a nenhuma pitada.
- Prepare uma solução de gonadotropina chorionica humana (HCG) contendo 10.000 U/mL em soro-de-soro estéril.
- Usando uma seringa de insulina de 30 G, injete 0,15 CC de HCG (1.500 unidades) na musculatura dorsal ao membro traseiro da fêmea anestesiada no ângulo de 45° até a linha média para evitar contato com a medula espinhal.
- Devolva a fêmea a uma solução de 40% de Holtfreter fresca e coloque em uma geladeira de 8-12 °C.
- Depois das 48h, volte a fêmea à temperatura ambiente. Coloque algumas pedras ou plantas plásticas em seu recipiente como superfícies para a colocação de ovos.
NOTA: As fêmeas injetadas com HCG muitas vezes depositarão caixas de geleia vazias por várias horas antes de colocar ovos. - Remova as pedras ou plantas plásticas depois que a fêmea começar a colocar ovos consistentemente.
- Deixe a fêmea sentar no tanque vazio por 30 min a 1 h.
NOTA: A retenção de materiais para o animal colocar ovos permitirá um controle mais rigoroso da coleta de oócitos.
- Coleção gamete masculina
- Enquanto a colocação de óvulos da fêmea está parada, anestesia um axolotl masculino GFP+ sexualmente maduro para servir como doador de esperma, como na etapa 2.1.1.
- Coloque o macho totalmente anestesiado nas costas em toalhas de papel úmidasob um microscópio dissecando.
- Se o experimentador for destro, posicione a ponta de uma pipeta P1000 na base da cloaca com a mão direita.
- Coloque o indicador esquerdo e o polegar da mão esquerda de 2-3 cm rostral na pélvis. Aperte suavemente o animal enquanto move os dedos em direção às pernas traseiras para limpar amostras de urina permiana.
- Colete cada um que seja expulso da cloaca em um tubo de microcentrífuga individual. Repita esse processo para coletar de 6 a 10 amostras.
- Pipette 5.0 μL de cada amostra em uma placa de petri para inspecionar a qualidade do esperma usando um microscópio invertido.
NOTA: Amostras concentradas de esperma são uma cor branca leitosa, normalmente variam de 5 a 20 μL, e geralmente são recuperadas após várias amostras de urina permiana de maior volume serem extraídas. O esperma será coletado na parte inferior dos tubos em amostras de maior volume quando não for incomodado. Amostras concentradas de esperma saudável são altamente motile e perdem atividade à medida que sua concentração diminui. Machos saudáveis podem produzir até 50 μL de esperma concentrado.
- Coleção gamete feminina
- Depois de obter e confirmar uma amostra de esperma saudável, anestesia o axolotl feminino injetado no HCG como na etapa 2.1.1.
- Coloque a fêmea totalmente anestesiada em toalhas de papel úmidas nas costas.
- Extrair ovos não fertilizados da fêmea usando um movimento de mão semelhante ao da etapa 2.2.4.
- Cole os ovos usando fórceps molhados e transfira-os para uma placa de petri de 10 cm. Trate óvulos com esperma irradiado dentro de 15 minutos de coleta.
- Preparação masculina de gamete e ativação in vitro
- Use uma pipeta P10 ou P20 para pipetar o esperma para cima e para baixo, quebrando os aglomerados para formar uma suspensão homogênea.
- Aproxima-se da porcentagem de esperma tomo colocando uma gota de 0,5 μL de suspensão de esperma não diluído em uma tampa de placa de petri ou slide de vidro e examinando com um microscópio invertido.
- Adicione 9,5 μL da solução modificada do Ringer de Marc (MMR; Tabela de Materiais) a esta amostra para fazer uma diluição de esperma 20x. Gentilmente pipette para cima e para baixo para misturar.
- Com um microscópio invertido, conte o esperma em três gotas de 1,0 μL da alíquota diluída de 20x em uma tampa de placa de petri ou hemocímetro para estimar a concentração de espermatozoides da suspensão não diluída.
- Prepare o esperma para irradiação diluindo uma alíquota da amostra original de esperma tonal para cerca de 80.000 células motile/mL em 0,1x RM estéreis.
- Conte o número de óvulos obtidos nos últimos 15 minutos. Adicione 0,5 μL do esperma recém-diluído da etapa 2.4,5 por óvulo a uma placa de petri. Use a ponta da pipeta para espalhar esta suspensão em uma camada de 1 mm de espessura.
- Usando um elevador de plástico, coloque a amostra de 4 cm das lâmpadas de um cruzador de 254 nm. Inative geneticamente o esperma irradiando a amostra com 800.000 uJ/mm2.
- Usando uma pipeta P10, pipeta a suspensão sobre os óvulos não fertilizados, revestindo cada óvulo com 0,25-0,5 μL de esperma irradiado. Deixe os ovos sentarem-se à temperatura ambiente por 30 min.
- Após 30 min, inundar os ovos com 0,1x MMR. Coloque imediatamente os ovos em uma incubadora de 8-10 °C para injeções no dia seguinte ou a 18 °C para injeções dentro de 7 horas após a ativação (hpa).
- Degeleia haploides usando fórceps afiados 30 min após a hidratação. Coloque imediatamente os ovos em uma incubadora de 8-10 °C para injeções no dia seguinte ou a 18 °C para injeções no mesmo dia.
3. Mutagênese e Manutenção haploides
- Microinjeçãos CRISPR/Cas9
- Design sgRNAs usando CRISPRscan e sintetizar26,27.
- Para mutação multiplex, prepare um estoque de 5 sgRNAs (10 ng/μL para cada sgRNA) e proteína Cas9 (1 μg/μL). Prepare uma diluição de 100 vezes deste estoque (0,1 ng/μL por sgRNA, 10 ng/μL Cas9) para injeção. Para um gene único, a mutação de alta frequência de mutação, siga o protocolo descrito anteriormenteem 28.
- Injete embriões haploides no estágio 7 hpa de célula única se armazenado a 18 °C ou injete embriões no dia seguinte no estágio celular 2-8 se forarmazenado a 8-10 °C.
- Transfira os embriões para 1,0x MMR com 20% de polisucrose 400.
- Se uma única célula, injete cada embrião com uma gota de 5 nL da solução de injeção (aproximadamente 1/4 raio do ovo) contendo uma massa total de 0,5 pg/sgRNA e 50 pg proteína Cas9. Se multicelular, distribua esta massa injetando volumes menores em múltiplas células.
- Permita que os embriões se curem na polisucrose 400 por uma mínima de 4h e máxima de 18 h a 18 °C.
- Habitação de embrião haploide
- Transfira os embriões para 0,1x MMR com antibiótico-antimicótico.
- Abrigar cada embrião em um poço individual de uma placa de 24 poços, como alguns morrerão ou se desenvolverão anormalmente. Mantenha-se em 16-18 °C. Temperaturas mais baixas podem ser usadas para prolongar o desenvolvimento, se necessário.
- Substitua a mídia por mmr fresco 0,1x por antibiótico-antimicótico a cada dois dias.
4. Preparação do embrião do hospedeiro diploide
- Mantenha os embriões no revestimento de geleia de 12 a 16 °C até chegarem ao estágio 22 a 26.
- Colete os embriões prontos para enxerto, coloque-os dentro de uma peneira (tamanho de malha de 4 mm) e enxágue-os suavemente com 40% de solução de Holtfreter.
- Transfira os embriões para o filtro esterilizado 0,1x MMR contendo 1,5% de alvejante por até 2 min. submerga completamente os embriões na solução de alvejante e gire-os suavemente para garantir que o revestimento de geleia faça contato total com a solução de alvejante para matar os micróbios presentes nos embriões.
- Após 2 min, diluir a solução alvejante contendo os embriões com um volume igual de MMR esterilizado por filtro0,1x.
- Despeje suavemente os embriões em uma peneira higienizada (tamanho de malha de 4 mm) e enxágue os embriões cinco vezes com mmr esterilizado pelo filtro 0,1x.
- Coloque os embriões em pratos de petri estéreis de 10 cm com 0,1x MMR com antibióticos para desjellying (penicilina 100 unidades/mL, estreptomicina 100 μg/μL, 0,25 μg/mL, gentamicina 25 μg/mL).
- um estereótipo fluorescente, remova as camadas de geleia e membranas de vitellina de embriões GFP+ usando fórceps afiados (dimensões de ponta 0,05 x 0,01 mm2).
- Transfira os embriões GFP+ para uma nova placa de petri. Minimize a quantidade de líquido transferido da placa de petri onde eles foram desembolsados.
- Enxágüe os embriões hospedeiros GFP+ com MMR estéril de 0,1x com antibióticos de quatro a seis vezes para remover contaminantes.
- Coloque os embriões limpos a 4 °C durante a noite antes de enxertar.
NOTA: O resfriamento dos embriões os torna mais rígidos e limpos separação do mesoderme do endódrmevio viável.
5. Haploid-diploid Chimera Generation
- Preparação cirúrgica de pratos e mídia
- Prepare pratos cirúrgicos estéreis derramando 2% de agarose autolava em 0,1x MMR em pratos de petri de 35 mm estéreis. Encha as placas de petri no meio do caminho com agarose.
- Depois que a agarose esfria, use um bisturi estéril para cortar um cocho inclinado de 25 mm de comprimento na agarose para manter os embriões no lugar.
- Encha o prato com mídia cirúrgica estéril (0,1x MMR com anti-micoplasma 2,5 μg/mL, amphoticina B 0,25 μg/mL, e ciprofloxacina 10,0 μg/mL) e refrigeração a 4 °C.
- Procedimento de enxerto de embriões
- Coloque um doador de haploide saudável com um ou dois embriões de hospedeiro gfp+ compatíveis com estágio dentro do cocho da prato operacional pré-refrigerado contendo mídia cirúrgica (Figura 3).
NOTA: Realize o procedimento em um estágio de resfriamento (10 °C ou inferior) se possível. - Use dois fórceps ultrafinos e autocelavos (ponta reta, dimensões de ponta 0,05 x 0,02 mm2) para remover as camadas de ectoderme e mesoderme do hospedeiro com o botão do membro perto do centro(Figura 4).
NOTA: A região de enxerto de tecido retangular abrange o broto do membro e estende-se do nono somite à metade posterior da protuberância da brânquia, cerca de 2 mm, ao longo do eixo posterior anterior. Ao longo do eixo dorsoventral, a região enxertada abrange aproximadamente 1,5 mm, incluindo os somitas para um pouco além da borda ventral da protuberância da brânquia. A região enxertada inclui todo o mesoderme de placa lateral e as metades laterais dos somitas, sem perturbar o endódrio subjacente. Veja a Figura 4 e o vídeo que acompanha para obter detalhes. - Reserve o tecido hospedeiro e remova uma folha de tecido de tamanho equivalente do doador haploide usando os mesmos métodos.
- Coloque a folha de tecido dodoador haploide na região correspondente do embrião doador.
- Proteja o tecido cobrindo-o com um fragmento de vidro retangular autocolado de um vidro de cobertura de microscópio esmagado e pressionando-o suavemente para o corpo do embrião hospedeiro.
- Inverta o embrião doador haploide para o outro lado para colher o broto do membro para o segundo embrião hospedeiro. Repita os passos 5.2.2 a 5.2.5.
- Remova cuidadosamente o excesso restante de tecidos hospedeiros e o embrião doador do prato.
- Deixe os enxertos com as âncoras de caco de vidro no lugar por 60-75 min, verificando a cada 20 min para garantir que o vidro não tenha escorregado.
- Depois que os enxertos de tecido aderirem totalmente, use os fórceps para descascar lentamente as âncoras de cacos de vidro.
- Coloque um doador de haploide saudável com um ou dois embriões de hospedeiro gfp+ compatíveis com estágio dentro do cocho da prato operacional pré-refrigerado contendo mídia cirúrgica (Figura 3).
- Manutenção de Quimera
- Transfira os embriões enenxertou para uma nova mídia cirúrgica e mantenha-os em 8-12 °C durante a noite para curar. Abrigar embriões individualmente enertados em placas de 12 ou 24 poços.
- Depois de 36-48 h, transfira os embriões enenxertou para estéril 0,1x antibiótico-antimicótico MMR. Os antibióticos fortes na mídia cirúrgica causam toxicidade em embriões enenxertos após 3 dias.
- Substitua a mídia por mmr fresco sem e 0,1x MMR e antibióticos a cada 2-3 dias.
- Mantenha os embriões enenxertoados a 18 °C até que eles sejam capazes de alimentar28.
- Após 1 a 2 meses de desenvolvimento e cuidado, membros haploides podem ser pontuados por pureza do enxerto usando um microscópio de dissecação fluorescente.
NOTA: A presença de tecido GFP não-neural ou não derivado do hospedeiro nos membros é um indicador de enxerto impuro e muitas vezes está associada ao desenvolvimento anormal dos membros. Esses animais devem ser excluídos de análises posteriores.
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Representative Results
O desenvolvimento de embriões haploides pode ser distinguido de embriões diploides pelo fenótipo29da sua "síndrome haploide". Em estágio de enxerto, os embriões haploides exibem curvatura reduzida ao longo do eixo anterior-posterior e cerco incompleto do plugue de gema (Figura 3A). Um microscópio fluorescente pode ser usado para garantir que os embriões haploides estejam livres de expressão gfp paternalmente derivada(Figura 3B).
Quando os enxertos estão limpos, a expressão GFP deve ser limitada principalmente ao plexo braquial, a rede neural derivada da medula espinhal do hospedeiro, como visto na Figura 2. A expressão de GFP punctate também estará presente em células únicas que parecem ser neurônios sensoriais e células hospedeiras derivadas do sangue, que migram para o membro em desenvolvimento. Quando os doadores RFP+ forem usados, os membros do enxerto haploide mostrarão expressão universal de RFP (Figura 1B'). Ao longo do desenvolvimento, os membros haploides não mutagenizados são significativamente mais curtos do que os membros dianteiros diploides opostos em animais quiméricos de tamanho(Figura 1B, Figura 1B'e Figura 5, n = 16 pares de membros, haploide médio = 0,522 cm, SD = ± 0,087 cm, média diploide = 0,667 cm, SD = ± 0,069 m, t-test emparelhado p-value < 0,0001, razão média = 0,784, SD = ± 0,113). Membros haploides não mutagenizados também se regeneram totalmente (regeneração completa de 4/4 haploides e 4/4 diploides, Figura 6), embora eles mostrem um leve atraso em chegar ao estágio de crescimento digital em comparação com diploides (n = 4 haploide, n = 4 diploid; 23 dias após a amputação: haploides = 3 paleta e 1 membros de estágio de crescimento digital; diploides = 4 membros de estágio de crescimento digital).
Enxerto bem-sucedido requer prática, e consistência vai variar dependendo das habilidades de micromanipulação do técnico e técnica estéril. Enxertos falhos e impuros produzem uma variedade de fenótipos, como visto na Figura 7 e Figura 8. Em nossas mãos, aproximadamente 38,7% (DS = ± 8,78%) de oócitos se desenvolvem em embriões haploides normalmente desenvolvidos e 11,1% (DS = ± 5,46%) de todos os enxertos haplóide-diploides produzem animais viáveis com membros haploides normalmente desenvolvidos e limpos(Figura 9).
Figura 1: Visão geral do protocolo e um exemplo de axolotl quimérico. (A)Esquemática delineando o tempo relativo das medidas tomadas para obter embriões, espermatozoides e óvulos diploides, a fim de gerar haploides e embriões quiméricos. (B) Imagem brilhante composta de um axolotl juvenil produzido por enxerto de broto de membro embrionário de um embrião haploide RFP+ para um hospedeiro diploide GFP +(B') Sobreposição de imagens fluorescentes verdes e vermelhas do mesmo axolotl juvenil de 8 cm. O membro haploide é grosseiramente normal, mas mais curto do que o membro diploide opositor. Barra de escala = 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 2: Imagem fluorescente de um membro haploide normalmente desenvolvido e limpo. GFP- membro haploide enxertado a um hospedeiro diploide GFP+ mostra padrão de expressão GFP que parece estar restrito aos nervos espinhais que inervam o membro (seta amarela) e neurônios sensoriais individuais e células derivadas do sangue (setas brancas). O membro retratado pertencia a um juvenil de 4 cm. Barra de escala = 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 3: Comparação de embriões diploides e haploides. (A) Imagem leve de diploides (esquerda) e haploides (direita). Observe a curvatura reduzida do eixo AP e o endóderm saliente dos embriões haploides (setas brancas). (B)Imagem fluorescente verde dos mesmos embriões. GFP-haplóides foram gerados usando óvulos de uma gfp-fêmea e esperma irradiado de um GFP+. Diploids são GFP+. Embriões retratados são aproximadamente estágio 2530. Encenação de séries. Barra de escala = 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 4: Esquemática delineando a extensão de um enxerto de broto haploide. (A) Vista lateral de um embrião haploide estágio 25. As linhas pontilhadas mostram a área aproximada que deve ser transplantada, em relação à protuberância de brânquias e broto de membros. (B) Esquema transverso da fase 25. As linhas pontilhadas mostram a área aproximada e os tipos de tecidos que devem ser removidos do hospedeiro e substituídos pelo tecido doador haploide correspondente. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 5: Comparação de comprimentos de membros haploides e diploides. (A) Espalhamento dos comprimentos dos membros haploides (rosa) e membros diploides opostos (verde) de 16 animais quiméricos de tamanho similar (média haploide = 0,522 cm, DS = ± 0,087 cm, média difóide = 0,667 cm, DD = ± 0,069 cm). Os membros foram medidos desde a base do zeugopod até a junção dos dígitos 2 e 3. (B) Parcela de dispersão do comprimento do membro haploide para proporções de comprimento do membro diploide dos 16 animais (razão média = 0,784, SD = ± 0,113 cm). (C) Espalhamento dos comprimentos do corpo (cm) das 16 quimeras medidas (comprimento médio animal = 8,72 cm ± 0,456 cm). Os animais foram medidos desde a ponta do focofamento até a ponta traseira. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 6: Comparação de regeneração em membros haploides e diploides. (A)Pré-amputação do membro haploide. (B)O mesmo membro haploide após a regeneração. (C)Pré-amputação do membro diploide. (D)O mesmo membro diploide após a regeneração. 4/4 membros haploides e 4/4 membros diploideregenerados com morfologia normal. Linhas pontilhadas pretas indicam o avião de amputação. Barras de escala = 1 mm. Amputações foram realizadas em animais juvenis com tamanho (8,5 cm). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 7: Exemplos de desenvolvimento normal e anormal de membros haploides. (A)Um membro haploide com morfologia grosseiramente normal. (B-E) Exemplos de enxertos que não conseguiram suportar o desenvolvimento completo do haploide. (B)Oligodactyly. (C)Mais severo oligodactyly. (D) Não existem estruturas digitais distintas. Semmembro. Os membros retratados pertencem a jovens de tamanho similar (8,0 a 10 cm). Barras de escala = 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Exemplos de células GFP+ em enxertos impuros de membros haploides. (A,A') Membro de enxerto haploide morfologicamente normal com células dipoides GFP+ na pele e esmalte (contorno branco tracelado) revelado por microscopia fluorescente. (B,B') Um membro haploide anormal enxertado com células gfp+ diploid contribuindo extensivamente para a derme e pele (contorno branco). (C,C') Um membro haploide anormal enxertado no qual a epiderme foi substituída por células dipoides GFP+ (contorno branco). Os membros retratados pertencem a jovens de tamanho similar (8,0 a 10,0 cm). Barra de escala = 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 9: Taxas de sucesso de embrião haploide e geração de membros haploides. (A)Percentual de embriões haploides viáveis gerados usando ativação in vitro. Os dados foram coletados de cinco experimentos independentes de ativação in vitro. Verde indica a fração de ovos que produziram embriões haploides estágio 25 que poderiam ser utilizados para enxerto (média = 38,7%, SD = ± 8,78%). Grey indica que a fração de ovos que não mostravam sinais de decote, eram inviáveis ou eram normais em desenvolvimento. (B)Por cento dos membros haploides normalmente desenvolvidos e enxertados. Roxo indica a fração de enxertos que renderam membros heplóides limpos e normalmente desenvolvidos (média = 11,1%, SD = ± 5,46%). Verde indica membros que se desenvolveram normalmente, mas apresentaram tecidos hospedeiros GFP+ contaminados (média = 11,3%, SD = ± 8,64%). Vermelho indica membros de enxerto que não se desenvolveram normalmente (média = 27,1%, DS = ± 30,3%). O azul indica todos os embriões e animais enxertados que não sobreviveram ao desenvolvimento completo dos membros (média = 50,5%, SD = ± 31,2%). A perda de animais enxertados foi distribuída em estágios embrionários e larvais tardios. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
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Discussion
Existem alguns passos críticos em nosso protocolo para gerar quimeras haplóide-ddiploide que o técnico operacional deve considerar para resultados consistentes de enxerto.
A razão mais provável para a geração haploide falhar é devido às más condições de ativação in vitro. As quantidades adequadas de espermatozoides motile devem ser usadas para ativar óvulos. Para prolongar a motilidade, as amostras de esperma devem ser sempre mantidas a 4 °C. Antes de aplicar qualquer amostra de esperma aos óvulos, verifique a viabilidade do esperma usando um microscópio invertido. O esperma totalmente não motil nunca deve ser usado, e a concentração deve ser ajustada para 80.000 células motile/mL. Muito esperma na etapa de ativação também pode impedir o desenvolvimento normal de óvulos. Poços de esperma, que aparecem como pequenos recuos escuros na superfície do óvulo, são uma indicação física de que uma célula de esperma penetrou no óvulo e normalmente aparecem de 20 a 60 min depois de aplicar esperma. Ovos com dez ou mais poços de esperma podem não ser ativados corretamente.
Os óvulos não fertilizados podem ser ativados se coletados dentro de 15 minutos após serem colocados a água, colocados em uma placa de petri seca e secos completamente com toalhas de papel antes da aplicação do esperma. Alternativamente, como mostrado no vídeo, os ovos podem ser espremidos de uma fêmea injetada em hormônios. Descobrimos que esses ovos "secos" dão resultados mais consistentes, embora regularmente empregamos ambos os métodos.
Enxerto bem sucedido requer o acoplamento adequado de embriões diploides com tecido de broto haploide devidamente encenado. Este protocolo contém uma série de medidas para garantir a correspondência de palco. Como o acasalamento natural nem sempre resulta na colocação de ovos, a injeção de HCG para obter oócitos haploides não deve ser realizada até que a fêmea naturalmente acasalada comece a colocar ovos diploides. Após essa injeção, a fêmea induzida deve ser alojada a temperatura reduzida (8 a 12 °C), o que reduzirá a taxa de colocação de ovos. Abrigar a fêmea estimulada pelo hormônio a temperaturas normais pode resultar na maior parte dos ovos sendo colocados em um curto período de tempo. O início do ovo deitado em uma fêmea gelada indica que a fêmea está pronta para anestesia e extração oócito. A ativação do oócito deve ocorrer dentro de 15 minutos de extração de oócito. Como os embriões haploides ativados estarão vários dias atrás dos embriões diploides produzidos naturalmente em desenvolvimento, recomendamos incubar embriões diploides a 12 °C enquanto aumentamos a taxa relativa de desenvolvimento dos haploides, incubando-os a 18 °C. Como haverá alguma variação no intervalo entre injeção de HCG e colocação de óvulos de fêmeas induzidas, pequenos ajustes nas temperaturas de incubação de haploides ou diploides podem ser necessários para que a encenação de embriões hospedeiros e doadores sejam emparelhados no momento do enxerto. Os embriões devem ser refrigerados a 4 °C por várias horas antes do enxerto, e isso quase prende o desenvolvimento. Diferir o tempo de início de embriões heplóides e diploides antes do enxerto pode permitir a correspondência de palco. Enquanto os embriões haploides diferem morfologicamente dos diploides, tanto haploides quanto diploides chegam ao estágio 21 após o fechamento das dobras neurais e os embriões deitam um de seus lados. Como difóides, embriões haploides estágio 25 têm brânquias proeminentes e protuberâncias propensas. A cabeça grande se projeta em um ângulo relativo ao corpo em haploides, embora isso seja muito reduzido em relação aos embriões diploides estágio 25, cujas cabeças se projetam do corpo em quase um ângulo reto30.
A técnica estéril é absolutamente crítica para enxerto de tecido bem sucedido. Condições estéreis devem ser mantidas através de toda a experiência da geração haploide através do desenvolvimento embrionário das quimeras. Recomendamos manter todos os animais-mãe em condições de água limpas e não-do-sistema durante o período de colocação de ovos para minimizar a quantidade de material orgânico contaminante no início do procedimento. A remoção diária consistente de embriões falecidos ou moribundos através de todo o processo é importante para manter a saúde dos outros embriões. Recomendamos abrigar individualmente todos os embriões haploides e quimera para minimizar a contaminação cruzada.
As habilidades de microdissecção embrionária e enxerto de tecido são adquiridas através da prática. Durante o processo de enxerto, é importante não perfurar ou rasgar o próprio broto do membro. Os tecidos que estão sendo removidos do hospedeiro e embriões doadores devem se estender além do paladar do membro, como retratado, para fornecer uma zona tampão. Se muito pequeno de uma área de tecido for enxertado, os membros haploides serão infiltrados pela pele difóide GFP+ e outros tecidos.
Uma das limitações desta técnica de enxerto é que o tecido neural e o sangue nos membros são derivados do corpo hospedeiro. Em alguns casos raros, conseguimos gerar membros heplóides enxertados que não têm completamente todos os sinais de GFP+ expressando nervos. Nesses casos, conseguimos substituir o suficiente do tecido neural no animal hospedeiro pelo do doador. No entanto, tal enxerto extenso é difícil, não confiável, e muitas vezes produz anormalidades de desenvolvimento fora do membro.
Haploide é letal embrionário no axolotl. Da mesma forma, mutações em muitos genes potencialmente essenciais para o desenvolvimento e regeneração de membros também são letais embrionárias precoces. Nosso protocolo contorna a letalidade embrionária da heplóide para a produção de membros experimentais e também pode ser usado nos casos em que a mutação de um gene de regeneração de candidatoproduz um fenótipo letal embrionário. Nossa técnica de enxerto de bud amembro fornece uma vantagem para realizar isso versus métodos descritos anteriormente de broto de membros e enxerto de tecido contribuinte, como é realizado durante o desenvolvimento embrionário precoce e envolve o transplante de camadas completas de ectoderme e mesoderme1,2.
Enxerto de broto haploide foi descrito anteriormente; no entanto, neste estudo anterior, os botões de membros haploides foram enxertados ectópicomente31. A análise nuclear microscópica dos membros ectópicos derivados desses enxertos revelou extensas contribuições de tecido diploide. Enquanto esses membros se desenvolveram anormalmente, eles foram capazes de regenerar31. Em vez de enxertar botões de membros ectópicos, substituímos todo o broto de membros endógeno por tecidos haploides equivalentes. Através do uso de marcadores fluorescentes, somos capazes de identificar visualmente membros haploides que estão livres de contribuições difóides, com exceção do nervo e das células sanguíneas, sem sacrificar o próprio membro haploide. Descobrimos que os membros haploides se desenvolvem e se regeneram normalmente. No entanto, membros em que os hospedeiros gfp+ contribuem para tecidos diferentes de células neurais e derivadas do sangue frequentemente exibem anormalidades. Assim, ao investigar a função genética em membros haploides excessivos, aqueles com contribuições excessivas de hospedeiro devem ser excluídos da análise antes que um genótipo possa ser associado a qualquer fenótipo observado em membros haploides mutantes.
Inovações recentes, como a montagem do genoma axolotl e os recentes métodos inserinativos baseados em CRISPR/Cas15,16,32, expandiram drasticamente a maleabilidade genética do axolotl. Métodos para restringir as manipulações genéticas temporalmente e espacialmente têm grande promessa, mas suas aplicações atuais são restritas pelos recursos necessários para gerar, abrigar e distribuir linhas animais. O protocolo aqui detalhado acelera o processo pelo qual as consequências das perturbações genéticas dos genes podem ser investigadas no desenvolvimento e regeneração dos membros. Houve pouca caracterização de muitos dos genes encontrados para serem regulados em membros regeneradores, e esses genes podem estar envolvidos em uma variedade de processos essenciais de desenvolvimento e celular. Embora prevemos que muitos genes necessários para a regeneração dos membros também serão necessários para o desenvolvimento de membros, este método pode descobrir se quaisquer genes implicados na regeneração têm fenótipos de perda de função que são específicos para regeneração. A mutação CRISPR/Cas em axolotis normalmente produz mosaico axilica que inclui alelos de tipo selvagem retidos, e este mosaicismo em si pode ser considerado como um fenótipo quantificável20. Usando o Sequenciamento da Próxima Geração de membros originais amputados e regenerados, os pesquisadores podem quantificar se células haploides com mutações em um gene de interesse são preferencialmente perdidas após a regeneração. Essa abordagem pode permitir a investigação de fenótipos de regeneração produzidos pela perturbação de genes de desenvolvimento essenciais.
Telas genéticas haploides de perda de função facilitam a investigação das origens genéticas de muitos processos biológicos sem a necessidade de estabelecer linhas celulares mutantes biallálicos. Combinando haplogênese, mutagênese CRISPR/Cas9 e enxerto de bud amembro, fornecemos uma nova plataforma para uma tela genética haploide explorando o desenvolvimento e a regeneração de membros em um animal vivo.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Katherine Roberts por seus cuidados com a colônia de axolotl. O financiamento para este trabalho foi fornecido pelo Connecticut Innovations Regenerative Medicine Research Fund (15RMA-YALE-09 e 15-RMB-YALE-01) e pelo Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano Eunice Kennedy Shriver (Pós-Doutorado Individual Bolsa F32HD086942).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #55 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11295-1 | Only use Dumostar material (can be autoclaved) |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942-20ML | 20 mL |
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Thermo Fisher | 15240062 | |
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850-5G-F | |
| Ficoll 400 (polysucrose 400) | bioworld | 40600032-3 | Ficoll 400 |
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1914-250MG | |
| Heating/Cooling Incubator | RevSci | RS-IF-233 | |
| Human Chorionic Gonadotropin | Merk | Chorulon | |
| Megascript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher | AM1334 | 40 reactions |
| Miroscope Cooling Stage | Brook Industries | Custom | Custom |
| NLS Cas9 Protein | PNAbio | CP01-200 | 4 vials of 50 µg protein each |
| Plasmocin | Invivogen | ant-mpt-1 | Treatment level |
| Recipes | |||
| 1.0x Marc's modified Ringer's solution (MMR) | 0.1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0.1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7.8), ph 7.4 | ||
| 40% Holtfreter's solution | 20 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM NaHCO3, 0.2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH to 7.4 |
References
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