Generation von Chimeric Axolotls mit Mutant Haploid Limbs Durch Embryonale Grafting
Summary
Dieses Ziel dieses Protokolls ist es, chimäre Axolotle mit haploiden Vorderbeinen aus Cas9-mutagenisiertem Spendergewebe unter Verwendung embryonaler Gewebetransplantationstechniken zu produzieren.
Abstract
Eine wachsende Reihe von genetischen Techniken und Ressourcen ermöglichen es Forschern, die molekularen Ursprünge der Fähigkeit einiger Salamanderarten, wie Axolotls, ganze Gliedmaßen als Erwachsene zu regenerieren, zu erforschen. Hier skizzieren wir Techniken zur Erzeugung von chimerischen Axolotls mit Cas9-mutagenisierten haploiden Vorderbeinen, die zur Erforschung der Genfunktion und der Genauigkeit der Gliedmaßenregeneration verwendet werden können. Wir kombinieren mehrere embryologische und genetische Techniken, einschließlich der haploiden Erzeugung mittels In-vitro-Aktivierung, CRISPR/Cas9-Mutagenese und Gewebetransplantation in einem Protokoll, um ein einzigartiges System für haploidgenetisches Screening in einem Modellorganismus der Regeneration zu produzieren. Diese Strategie reduziert die Anzahl der Tiere, den Raum und den Zeitaufwand für die funktionelle Analyse von Genen bei der Regeneration der Gliedmaßen. Dies ermöglicht auch die Untersuchung von regenerationsspezifischen Funktionen von Genen, die für andere wesentliche Prozesse wie Organogenese, Gewebemorphogenese und andere wesentliche embryonale Prozesse erforderlich sein können. Die hier beschriebene Methode ist eine einzigartige Plattform für die Durchführung haploider genetischer Screenings in einem Wirbeltiermodellsystem.
Introduction
Historisch gesehen war die embryonale Gewebetransplantation in Amphibien eine wichtige Technik zur Erforschung grundlegender Mechanismen der Entwicklungsbiologie und Regeneration. Das Axolotl, eine Salamanderart, besitzt eine beeindruckende Fähigkeit, Gewebe und komplexe Strukturen wie Gliedmaßen und Organe nach Verletzungen oder Amputationen zu regenerieren. Ebenso beeindruckend können sie ohne Abstoßung Gewebetransplantate von anderen Individuen in embryonalen, juvenilen und erwachsenen Stadien1,2,3erhalten. Regionen von Embryonen, die ganze Strukturen wie Gliedmaßen, Schwänze, Augen und Köpfe produzieren, und spezifischere Gewebe, wie Neuroektoderm und Soden, können zwischen Embryonen gepfropft werden, um chimäre Tiere zu produzieren1,2,4,5,6. Seit fast einem Jahrhundert liefern Studien an solchen chimertieren den entscheidenden Einblicken in Regeneration, Gewebedifferenzierung, Größenkontrolle und Musterung1,7,8.
In den letzten zehn Jahren haben zahlreiche transkriptionelle Studien an regenerierenden Geweben Einblicke in die genetischen Programme der Salamanderregeneration9,10,11,12,13. Diese Studien haben zu einer wachsenden Liste von Kandidatengenen hinzugefügt, die bis heute im Kontext der Regeneration weitgehend uncharakterisiert sind. Gezielte Mutagenesetechniken wie CRISPR/Cas ermöglichen nun die Untersuchung solcher Gene, und solche genetischen Ansätze werden durch die kürzliche Sequenzierung und Montage des großen Axolotl-Genoms14,15,16erheblich erleichtert.
Wir versuchten, Techniken zu entwickeln, die klassische Entwicklungsbiologie mit neuer Gentechnologie koppelten, um die Mechanismen der Regeneration zu sezieren. Methoden zur Erzeugung haploider Embryonen von Axolotls und anderen Salamandern sind seit Jahrzehnten etabliert17. Während diese Techniken seit langem als Vorteile von Salamandern als genetische Modellorganismen18bezeichnet werden, haben nur wenige nachfolgende genetische Studien haploide Tiere aufgenommen. Wir verwenden In-vitro-Aktivierung im Axolotl, um haploide Embryonen zu produzieren, die als Gewebespender für die Transplantation dienen19. Mit Embryonen, die fluoreszierende genetische Marker tragen, haben wir zuverlässige Methoden zur Erzeugung von Gliedmaßen entwickelt, die fast ausschließlich aus Spendergeweben gewonnen wurden (Abbildung 1A). Durch die Kombination dieser beiden Techniken haben wir die späte embryonale Letalität im Zusammenhang mit der Haploidie umgangen, die die Produktion voll entwickelter, transplantierter haploider Gliedmaßen ermöglicht (Abbildung 1B, Abbildung 1B”und Abbildung 2).
Durch die Durchführung von CRISPR/Cas-vermittelter Mutagenese in haploiden Embryonen vor der Transplantation zur Herstellung von chimerischen Axolotlen mit mutierten haploiden Gliedmaßen können wir die Genfunktion speziell im Kontext der Gliedmaßenentwicklung und -regeneration untersuchen. Dies ermöglicht die Rettung von Gliedmaßen von potenziell embryonal-tödlichen mutierten Phänotypen. Während CRISPR/Cas Mikroinjektion Tiere erzeugen kann, die stark mutiert sind, sind solche Tiere in der Regel sehr mosaikartig, mit einem gewissen Grad an Retention von Wildtyp-Allelen und einer Vielzahl von unterschiedlichen Mutationen an den Zielstellen14,20. CRISPR-basierte Mutagenese in haploiden Zellen erhöht die Penetranz einzelner Allelverlust-der-Funktionsmutationen, da sie nicht durch zurückgehaltene Wildtyp-Allele maskiert werden können. Aus diesem Grund wird DAS CRISPR-basierte Screening in haploiden Zelllinien zunehmend zur Untersuchung der genetischen Grundlagen vieler zellulärer Prozesse21,22,23verwendet. Durch die Kombination von CRISPR-basierter Linienverfolgung mit unseren haploiden Gliedmaßenknospen-Pfropfprotokollen kann der hier beschriebene Ansatz als Plattform für haploide genetische Screens bei lebenden Tieren dienen20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt einige kritische Schritte in unserem Protokoll zur Erzeugung von haploid-diploiden Chimären, die der Betriebstechniker für konsistente Pfropfergebnisse berücksichtigen sollte.
Der wahrscheinlichste Grund für haploid-Generation zu scheitern ist aufgrund schlechter In-vitro-AktivierungBedingungen. Die richtigen Mengen an motilen Spermien müssen verwendet werden, um Eier zu aktivieren. Um die Beweglichkeit zu verlängern, sollten Spermienproben immer bei 4 °C gehalten werden. Bevor …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Katherine Roberts für ihre Pflege der Axolotl-Kolonie. Die Finanzierung dieser Arbeit wurde vom Connecticut Innovations Regenerative Medicine Research Fund (15RMA-YALE-09 und 15-RMB-YALE-01) und dem Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (Individual Postdoctoral) bereitgestellt. Stipendium F32HD086942).
Materials
| #55 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11295-1 | Only use Dumostar material (can be autoclaved) |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942-20ML | 20 mL |
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Thermo Fisher | 15240062 | |
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850-5G-F | |
| Ficoll 400 (polysucrose 400) | bioworld | 40600032-3 | Ficoll 400 |
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1914-250MG | |
| Heating/Cooling Incubator | RevSci | RS-IF-233 | |
| Human Chorionic Gonadotropin | Merk | Chorulon | |
| Megascript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher | AM1334 | 40 reactions |
| Miroscope Cooling Stage | Brook Industries | Custom | Custom |
| NLS Cas9 Protein | PNAbio | CP01-200 | 4 vials of 50 µg protein each |
| Plasmocin | Invivogen | ant-mpt-1 | Treatment level |
| Recipes | |||
| 1.0x Marc's modified Ringer's solution (MMR) | 0.1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0.1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7.8), ph 7.4 | ||
| 40% Holtfreter's solution | 20 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM NaHCO3, 0.2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH to 7.4 |
References
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