Een Ectopic Chemokine-expressie model voor het testen van macrophage Recruitment in vivo
Summary
Om het effect van een Chemokine op macrofaag werving in vivo te testen, werd de hele mount in situ-hybridisatie gebruikt om de ectopische uitdrukking van de Chemokine te detecteren en werd immunokleuring gebruikt om macrofagen te labelen. Live Imaging werd gebruikt voor real-time observatie van macrofaag migratie.
Abstract
Zebravis wordt veel gebruikt in het basis-en biomedisch onderzoek. Veel zebravis transgene lijnen zijn momenteel beschikbaar om verschillende soorten cellen te labelen. Door het transparante embryonale lichaam van zebravis is het voor ons handig om het effect van één Chemokine op het gedrag van een bepaald type cellen in vivo te bestuderen. Hier hebben we een workflow gegeven om de functie van een Chemokine op macrofaag migratie in vivo te onderzoeken. We bouwden een Weefselspecifieke overexpressie plasmide om de IL-34 te overdrukken en injecteerde het plasmide in ééncellige transgene visembryo’s waarvan de macrofagen specifiek werden gelabeld door een fluorescerend eiwit. Vervolgens gebruikten we hele Mount fluorescerende in-situ hybridisatie en immunokleuring om het patroon van de Chemokine expressie en het aantal of de locatie van macrofagen op te sporen. De geïnjecteerde WT-embryo’s werden verhoogd om een stabiele transgene lijn te genereren. Tot slot gebruikten we confocale Live beeldvorming om het macrofaag gedrag in de stabiele transgene vis direct te observeren om de functie van IL-34 op macrofagen in vivo te bestuderen.
Introduction
Zebravis is een kleine tropische zoet water vis afkomstig uit India. Wat betreft het behoud van genen, zebravis hebben een gelijkenis van 87% voor de menselijke1. Het kan ons inzicht geven in Verwante onderwerpen van mensen door het bestuderen van de genregulatie, eiwit functie en Celgedrag zoals migratie, proliferatie et.al in zebravis. Zebravis embryo kan worden gebruikt om de ontwikkeling van vroege embryo’s in verschillende stadia na remming van pigment te observeren. Ondertussen duurt het slechts drie maanden voordat zebravis zich tot seksuele volwassenheid ontwikkelt, waarna de zebravissen elke 4 dagen honderden eieren kunnen produceren. Mini formaat, eenvoudige fokkerij, sterke reproductieve capaciteit, deze voordelen maken zebravis cultuur zeer ruimtebesparend, bevorderlijk voor grootschalige cultuur. Het traditionele zoogdier model muis heeft hogere onderhoudskosten dan zebravis, waardoor de schaal van muis verhoging wordt beperkt. In het aspect van de vroege embryo ontwikkeling is muis embryo moeilijk te observeren in levende toestand als gevolg van de kenmerken van de ontwikkeling van muizen embryo’s in de moeder baarmoeder. Integendeel, zebravis embryo’s ontwikkelen zich extern en zijn transparant, daarom zijn ze gemakkelijk te observeren onder een microscoop. Bovendien is zebravis heel eenvoudig om een verscheidenheid aan transgene lijnen te construeren voor gerelateerd genfunctieonderzoek. Momenteel zijn verschillende zebravis transgene lijnen beschikbaar om verschillende soorten cellen te labelen. Het is nu erg handig om transgene lijnen te construeren om chemokines op specifieke locaties te overdrukken en de chemokines-functie op Celgedrag in zebravis te bestuderen.
Hier hebben we een workflow voor het gebruik van zebravis transgene lijn voor het onderzoeken van de functie van Il-34 op macrofaag gedrag in vivo2,3,4,5,6,7. Ten eerste bouwden we een leverspecifieke overexpressie plasmide van het gen il34 en injecteerde het plasmide in ééncellige fase TG (MPEG1: GFP) visembryo’s die specifiek de macrofagen met fluorescerende proteïne GFP gelabeld. Vervolgens gebruikten we hele Mount fluorescerende in-situ hybridisatie en immunokleuring om het patroon van de il34 expressie en het aantal of de locatie van macrofagen te detecteren. De geïnjecteerde WT-embryo’s werden verhoogd om een stabiele transgene lijn te genereren. In deze stappen hebben we de cytokine-producerende lijn vastgesteld en gevalideerd en visueel beoordeeld welke effecten kunnen worden gezien op de macrofaag verdeling. Tot slot, om het macrofaag gedrag te onderzoeken in reactie op de cytokine, gebruikten we confocale Live Imaging om direct de macrofaag migratie te observeren om de functie van il34 op de macrofaag migratie in vivo te bevestigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hier beschreven protocol stelt ons in staat om de functie van een Chemokine op het gedrag van macrophagein vivo te onderzoeken en de procedure vereist enige technische expertise. Samenvattend zijn er verschillende kritieke stappen om complicaties in het protocol te voorkomen: 1) Selecteer een geschikte transgene lijn die een specifiek en sterk transgene signaal toont om de cel van belang te labelen; 2) Selecteer een geschikt weefsel dat toegankelijk is voorbeeld vorming en transgene genen overexpressie; 3) Maak een g…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Dr. Jingrong Peng voor het delen van de TG (fabp10a: DsRed) transgene lijn; Dr. Zilong Wen voor het delen van de TG (MPEG1: GFP) transgene lijnen; Dr. Koichi Kawakami voor het leveren van de pTol2 vector. Dit werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (31771594), Guangdong Science and Technology plan Projects (2019A030317001) en de fundamentele onderzoeksfondsen voor de centrale universiteiten (D2191450).
Materials
| Antibody | |||
| Alexa 488-Anti-Goat antibody | Invitrogen | A11055 | |
| Anti-Digoxigenin-HRP | perkinelmer | NEF832001EA | |
| Goat-Anti-GFP antibody | Abcam | ab6658 | |
| Reagent | |||
| CaCl2· 2H2O | Sigma | 21097 | |
| Cyanine 3 Plus Amplification Reagent | perkinelmer | NEL745001KT | |
| E2 solution | 15 mM NaCl +0.5 mM KCl +1.0 mM MgSO4+150 µM KH2PO4 + 50 µM Na2HPO4 +1.0 mM CaCl2 + 0.7 mM NaHCO3 | ||
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Life | 10099-133 | |
| formamide | Diamond | A100314 | |
| glycerol | Sigma | V900860 | |
| heparin sodium | Sigma | H3149 | |
| hybridization buffer(HB) | 50% formamide+ 5×SSC+9 mM sodium citrate+50 μg/ml heparin sodium+ 500 μg/ml tRNA+ 0.1% Tween20 | ||
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| low melting agarose | Sigma | A9414 | |
| methanol | GHTECH | 1.17112.023 | |
| methylene blue | Sigma | M9140 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S5136 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| paraformaldehyde(PFA) | Sigma | 158127 | Suspend 16 g of PFA in 400 ml of 1x PBS, heat at 60 °C to dissolve about 30 min. This solution can be prepared in advance and stored at -4 °C. Caution. Manipulate with mask. |
| 10×PBS | 14.2 g Na2HPO4+80 g NaCl+2 g KCl+ 2.4 g KH2PO4 in 1L ddH2O | ||
| phenylthiourea(PTU) | Sigma | P7629 | |
| 1×Plus Amplification Diluent | perkinelmer | NEL745001KT | |
| Proteinase K | Fermentas | E00492 | |
| 20×Saline sodium citrate(SSC) | 175.3 g NaCl+ 88.2 g sodium citrate in 1 L ddH2O, PH 7.0 | ||
| sodium citrate | Sigma | A5040 | |
| tricaine | Sigma | E10521 | |
| tRNA | Sigma | R6625 | |
| Tween20 | Sigma | P2287 | |
| Plasmid | |||
| pBLK-fabp10a-il34-sv40 | For Tg (fab10a:il34) transgenic line generation | ||
| pBSK-il34 | For il34 probe preparation | ||
| Fish | |||
| Tg (mpeg1: GFP) | Label macrophages with GFP | ||
| Tg (fabp10a: DsRed) | Label liver cells with DsRed | ||
| Tg (fab10a:il34) | Over-expression IL-34 in liver cells |
References
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Wang, Y., et al. IL-34 is a tissue-restricted ligand of CSF1R required for the development of Langerhans cells and microglia. Nature Immunology. 13 (8), 753-760 (2012).
- Lin, H., et al. Discovery of a cytokine and its receptor by functional screening of the extracellular proteome. Science. 320 (5877), 807-811 (2008).
- Wei, S., et al. Functional overlap but differential expression of CSF-1 and IL-34 in their CSF-1 receptor-mediated regulation of myeloid cells. Journal of leukocyte biology. 88 (3), 495-505 (2010).
- Etienne, D., Foucher, S. B. L. P., Norbert Ifrah, P. G. Y. D. IL-34 Induces the Differentiation of Human Monocytes into Immunosuppressive Macrophages. Antagonistic Effects of GM-CSF and IFNc. PLoS One. 8 (2), e56045 (2013).
- Segaliny, A. I., et al. Syndecan-1 regulates the biological activities of interleukin-34. Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (5), 1010-1021 (2015).
- Zhou, S. L., et al. miR-28-5p-IL-34-macrophage feedback loop modulates hepatocellular carcinoma metastasis. Hepatology. 63 (5), 1560-1575 (2016).
- Gordon, J. I., et al. Tissue specific expression and developmental regulation of two genes coding for rat fatty acid binding proteins. Journal of Biological Chemistry. 260 (4), 1995-1998 (1985).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish: a practical approach. , (2002).
- Jiang, Y., Chen, J., Yen, K., Xu, J. Ectopically Expressed IL-34 Can Efficiently Induce Macrophage Migration to the Liver in Zebrafish. Zebrafish. 16 (2), 165-170 (2019).
