כימוקין חוץ רחמי ביטוי מודל לבדיקת גיוס מקרופאג ב Vivo
Summary
כדי לבדוק את ההשפעה של כימוקין על גיוס מקרופאג ב vivo, את כל הר היברידיזציה באתרו שימש כדי לזהות את הביטוי החוץ רחמי של כימוקין, וכתמים חיסוני שימש תוויות מקרופאגים. הדמיה חיה שימש התבוננות בזמן אמת של הגירה מקרופאג.
Abstract
זברפיש משמשים רבות במחקר בסיסי וביורפואי. קווים הטרנסגניים רבים הזמינים כעת כדי לתייג סוגים שונים של תאים. בשל הגוף עובריים שקוף של דג zebrafish, זה נוח לנו ללמוד את ההשפעה של כימוקין אחד על ההתנהגות של סוג מסוים של תאים בvivo. כאן סיפקנו זרימת עבודה כדי לחקור את הפונקציה של כימוקין על הגירה מקרופאג ב vivo. בנינו ביטוי מופרז רקמות מוגזם כדי overexpression IL-34 והזריק את הפלבאמצע לתוך השלב תא אחד העוברים דגים מקרופאגים שסומנו במפורש על ידי חלבון פלורסנט. לאחר מכן השתמשנו פלואורסצנט הר שלם ב היברידיזציה באתרו ו חיסוני כדי לזהות את התבנית של הביטוי כימוקין ואת מספר או מיקום של מקרופאגים. עוברי WT מוזרק הועלו כדי ליצור קו טרנסגניים יציב. בסופו של דבר, השתמשנו קונפוקלית וקד חי הדמיה כדי להתבונן ישירות התנהגות מקרופאג בדגים טרנסגניים יציבה כדי ללמוד את הפונקציה של IL-34 על מקרופאגים ב vivo.
Introduction
Zebrafish הוא קטן טרופי קשה עצמות מתוקים דגים מקורו בהודו. בנוגע לשימור הגנים, יש דמיון של 87% לאדם1. זה יכול לספק לנו תובנות על נושאים קשורים של בני אדם על ידי לימוד רגולציה גנים, חלבון תפקוד והתנהגות התא כגון הגירה, הפצת et.al ב zebrafish. העובר מדגים ניתן להשתמש כדי להתבונן התפתחות של עוברים מוקדם בשלבים שונים לאחר פיגמנט מעכב. בינתיים, זה לוקח רק שלושה חודשים כדי להתפתח בגרות מינית, אז דג הדגים יכול לייצר מאות ביצים כל 4 ימים. מיני גודל, רבייה פשוטה, קיבולת הרבייה חזקה, יתרונות אלה להפוך תרבות דג זברה מאוד חיסכון בחלל, תורם לתרבות בקנה מידה גדול. העכבר מודל היונקים המסורתי יש עלויות תחזוקה גבוהה יותר מאשר zebrafish, ולכן הגבלת היקף העלאת העכבר. בהיבט של התפתחות העובר המוקדם, העובר העכבר קשה להתבונן במצב חי בשל מאפייני התפתחות העובר העכבר ברחם האם. להיפך, עוברי דג מפתחים מבחוץ ושקופים, לכן קל להתבונן מתחת למיקרוסקופ. יתר על כן, דג זברה הוא קל מאוד לבנות מגוון של קווים טרנסגניים למחקר הקשורים לפונקציות גן. כיום, קווים טרנסגניים שונים הניתנים להוספת תוויות לסוגים שונים של תאים. זה מאוד נוח עכשיו לבנות קווים טרנסגניים כדי overexpress נוגדנים במיקומים ספציפיים וללמוד את הפונקציה נוגדנים על התנהגות התא ב-zebrafish.
כאן, סיפקנו זרימת עבודה כדי להשתמש בשורה הטרנסגניים של הדגים כדי לחקור את הפונקציה של IL-34 על התנהגות מקרופאג ב vivo2,3,4,5,6,7. ראשית, אנו בנינו ביטוי מופרז של הכבד היתר פלבאמצע של הגן il34 והזריק את הפלבאמצע לשלב של תא אחד Tg (MPEG1: gfp) עוברי דגים אשר במפורש מתויג מקרופאגים על ידי חלבון פלורסנט gfp. אז, השתמשנו פלורסנט כל הר באתרו היברידיזציה החיסונית כדי לזהות את התבנית של הביטוי il34 ואת מספר או מיקום של מקרופאגים. עוברי WT מוזרק הועלו כדי ליצור קו טרנסגניים יציב. בשלבים אלה, הקמנו ובנו אימות של קו הייצור cytokine ויזואלית העריכו את ההשפעות שניתן לראות על התפלגות מקרופאג. לבסוף, כדי לחקור התנהגות מקרופאג בתגובה cytokine, השתמשנו הדמיה חיה קונפוקלית וקד להתבונן ישירות מקרופאג הגירה כדי לאשר את הפונקציה של il34 על הגירה מקרופאג בvivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר לנו לחקור את הפונקציה של כימוקין על ההתנהגות של macrophagein vivo וההליך דורש מומחיות טכנית מסוימת. לסיכום, ישנם מספר שלבים קריטיים כדי למנוע סיבוכים בפרוטוקול: 1) לבחור קו טרנסגניים מתאים אשר מציג אות הטרנסגניים ספציפיים וחזקים כדי לתייג את תא הריבית; 2) לבחור את הרקמה ה?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד ר ג’ינגרן פנג על שיתוף הקו הטרנסגניים של Tg (fabp10a: DsRed) ; ד ר זילונג וון על שיתוף הקווים הטרנסגניים של Tg (mpeg1: GFP) ; ד ר קואיצ’י קווקאמי על אספקת וקטור pTol2. עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (31771594), גואנג-דונג מדעי וטכנולוגיה תוכנית פרויקטים (2019A030317001) ואת קרנות המחקר הבסיסי של האוניברסיטאות המרכזיות (D2191450).
Materials
| Antibody | |||
| Alexa 488-Anti-Goat antibody | Invitrogen | A11055 | |
| Anti-Digoxigenin-HRP | perkinelmer | NEF832001EA | |
| Goat-Anti-GFP antibody | Abcam | ab6658 | |
| Reagent | |||
| CaCl2· 2H2O | Sigma | 21097 | |
| Cyanine 3 Plus Amplification Reagent | perkinelmer | NEL745001KT | |
| E2 solution | 15 mM NaCl +0.5 mM KCl +1.0 mM MgSO4+150 µM KH2PO4 + 50 µM Na2HPO4 +1.0 mM CaCl2 + 0.7 mM NaHCO3 | ||
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Life | 10099-133 | |
| formamide | Diamond | A100314 | |
| glycerol | Sigma | V900860 | |
| heparin sodium | Sigma | H3149 | |
| hybridization buffer(HB) | 50% formamide+ 5×SSC+9 mM sodium citrate+50 μg/ml heparin sodium+ 500 μg/ml tRNA+ 0.1% Tween20 | ||
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| low melting agarose | Sigma | A9414 | |
| methanol | GHTECH | 1.17112.023 | |
| methylene blue | Sigma | M9140 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S5136 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| paraformaldehyde(PFA) | Sigma | 158127 | Suspend 16 g of PFA in 400 ml of 1x PBS, heat at 60 °C to dissolve about 30 min. This solution can be prepared in advance and stored at -4 °C. Caution. Manipulate with mask. |
| 10×PBS | 14.2 g Na2HPO4+80 g NaCl+2 g KCl+ 2.4 g KH2PO4 in 1L ddH2O | ||
| phenylthiourea(PTU) | Sigma | P7629 | |
| 1×Plus Amplification Diluent | perkinelmer | NEL745001KT | |
| Proteinase K | Fermentas | E00492 | |
| 20×Saline sodium citrate(SSC) | 175.3 g NaCl+ 88.2 g sodium citrate in 1 L ddH2O, PH 7.0 | ||
| sodium citrate | Sigma | A5040 | |
| tricaine | Sigma | E10521 | |
| tRNA | Sigma | R6625 | |
| Tween20 | Sigma | P2287 | |
| Plasmid | |||
| pBLK-fabp10a-il34-sv40 | For Tg (fab10a:il34) transgenic line generation | ||
| pBSK-il34 | For il34 probe preparation | ||
| Fish | |||
| Tg (mpeg1: GFP) | Label macrophages with GFP | ||
| Tg (fabp10a: DsRed) | Label liver cells with DsRed | ||
| Tg (fab10a:il34) | Over-expression IL-34 in liver cells |
References
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Wang, Y., et al. IL-34 is a tissue-restricted ligand of CSF1R required for the development of Langerhans cells and microglia. Nature Immunology. 13 (8), 753-760 (2012).
- Lin, H., et al. Discovery of a cytokine and its receptor by functional screening of the extracellular proteome. Science. 320 (5877), 807-811 (2008).
- Wei, S., et al. Functional overlap but differential expression of CSF-1 and IL-34 in their CSF-1 receptor-mediated regulation of myeloid cells. Journal of leukocyte biology. 88 (3), 495-505 (2010).
- Etienne, D., Foucher, S. B. L. P., Norbert Ifrah, P. G. Y. D. IL-34 Induces the Differentiation of Human Monocytes into Immunosuppressive Macrophages. Antagonistic Effects of GM-CSF and IFNc. PLoS One. 8 (2), e56045 (2013).
- Segaliny, A. I., et al. Syndecan-1 regulates the biological activities of interleukin-34. Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (5), 1010-1021 (2015).
- Zhou, S. L., et al. miR-28-5p-IL-34-macrophage feedback loop modulates hepatocellular carcinoma metastasis. Hepatology. 63 (5), 1560-1575 (2016).
- Gordon, J. I., et al. Tissue specific expression and developmental regulation of two genes coding for rat fatty acid binding proteins. Journal of Biological Chemistry. 260 (4), 1995-1998 (1985).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish: a practical approach. , (2002).
- Jiang, Y., Chen, J., Yen, K., Xu, J. Ectopically Expressed IL-34 Can Efficiently Induce Macrophage Migration to the Liver in Zebrafish. Zebrafish. 16 (2), 165-170 (2019).
