विवो में मैक्रोफेज भर्ती के परीक्षण के लिए एक एटोपिक चेमोकिन अभिव्यक्ति मॉडल
Summary
विवो में मैक्रोफेज भर्ती पर एक chemokine के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए, situ संकरीकरण में पूरे माउंट chemokine के अस्थानिक अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था, और इम्यूनोस्टिपिंग मैक्रोफेज लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। मैक्रोफेज प्रवास के वास्तविक समय अवलोकन के लिए लाइव इमेजिंग का उपयोग किया गया था।
Abstract
ज़ेब्राफ़िश व्यापक रूप से बुनियादी और जैव चिकित्सा अनुसंधान में उपयोग किया जाता है। कई ज़ेब्राफ़िश ट्रांसजेनिक लाइनों वर्तमान में कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार के लेबल के लिए उपलब्ध हैं. जेब्राफ़िश के पारदर्शी भ्रूण ीय शरीर के कारण, विवो में एक निश्चित प्रकार की कोशिकाओं के व्यवहार पर एक कीमोकीन के प्रभाव का अध्ययन करना हमारे लिए सुविधाजनक है। यहाँ हम vivo में मैक्रोफेज प्रवास पर एक chemokine के समारोह की जांच करने के लिए एक कार्यप्रवाह प्रदान की है. हमने आईएल-34 को अधिक एक्स्प्रेस करने के लिए एक ऊतक-विशिष्ट ओवरएक्सप्रेशन प्लाज्मिड का निर्माण किया और एक-सेल चरण ट्रांसजेनिक मछली भ्रूण में प्लाज्मिड को इंजेक्ट किया, जिनके मैक्रोफेज को विशेष रूप से फ्लोरोसेंट प्रोटीन द्वारा लेबल किया गया था। हम तो situ संकरीकरण और इम्यूनोस्टेनिंग में पूरे माउंट फ्लोरोसेंट का इस्तेमाल किया chemokine अभिव्यक्ति के पैटर्न और संख्या या मैक्रोफेज के स्थान का पता लगाने के लिए. इंजेक्शन WT भ्रूण एक स्थिर ट्रांसजेनिक लाइन उत्पन्न करने के लिए उठाया गया था. अंत में, हम confocal लाइव इमेजिंग का इस्तेमाल किया सीधे स्थिर ट्रांसजेनिक मछली में मैक्रोफेज व्यवहार का निरीक्षण करने के लिए vivo में मैक्रोफेज पर आईएल-34 के समारोह का अध्ययन.
Introduction
ज़ेब्राफ़िश भारत में उत्पन्न होने वाली एक छोटी उष्णकटिबंधीय हार्ड-हड्डियों की मीठे पानी की मछली है। जीन संरक्षण के संबंध में, जेब्राफ़िश मानव1के लिए 87% की समानता है। यह हमें जीन विनियमन, प्रोटीन समारोह और इस तरह के प्रवास के रूप में सेल व्यवहार का अध्ययन करके मानव से संबंधित विषयों पर अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं, प्रसार et.al ज़ेब्राफ़िश में. ज़ेब्राफ़िश भ्रूण वर्णक को रोकने के बाद विभिन्न चरणों में प्रारंभिक भ्रूण के विकास का निरीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस बीच, यह यौन परिपक्वता में विकसित करने के लिए जेब्राफ़िश के लिए केवल तीन महीने लगते हैं, तो जेब्राफ़िश हर 4 दिनों में अंडे के सैकड़ों का उत्पादन कर सकते हैं। मिनी आकार, सरल प्रजनन, मजबूत प्रजनन क्षमता, इन लाभों ज़ेब्राफ़िश संस्कृति बहुत अंतरिक्ष की बचत, बड़े पैमाने पर संस्कृति के लिए अनुकूल बनाते हैं। पारंपरिक स्तनधारी मॉडल माउस ज़ेब्राफ़िश की तुलना में एक उच्च रखरखाव लागत है, इसलिए माउस उठाने के पैमाने को सीमित. प्रारंभिक भ्रूण के विकास के पहलू में, माँ के गर्भ में माउस भ्रूण विकास की विशेषताओं के कारण माउस भ्रूण को लाइव स्थिति में देखना मुश्किल है। इसके विपरीत, जेब्राफिश भ्रूण बाह्य रूप से विकसित होते हैं और पारदर्शी होते हैं, इसलिए उन्हें सूक्ष्मदर्शी के नीचे देखना आसान होता है। इसके अलावा, ज़ेब्राफ़िश संबंधित जीन समारोह अनुसंधान के लिए ट्रांसजेनिक लाइनों की एक किस्म का निर्माण करने के लिए बहुत आसान है। वर्तमान में, विभिन्न ज़ेब्राफ़िश ट्रांसजेनिक लाइनें विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं को लेबल करने के लिए उपलब्ध हैं। यह विशिष्ट स्थानों में chemokines overexpress करने के लिए ट्रांसजेनिक लाइनों का निर्माण और ज़ेब्राफ़िश में सेल व्यवहार पर chemokines समारोह का अध्ययन करने के लिए अब बहुत सुविधाजनक है।
यहाँ, हमने विवो2,3,4,5,6,7में मैक्रोफेज व्यवहार पर आईएल-34 के कार्य की जांच करने के लिए जेब्राफ़िश ट्रांसजेनिक लाइन का उपयोग करने के लिए एक कार्यप्रवाह प्रदान किया . सबसे पहले, हम जीन il34 के एक जिगर विशिष्ट overexpression प्लाज्मिड का निर्माण किया और एक सेल चरण Tg (mpeg1: GFP) मछली भ्रूण जो विशेष रूप से फ्लोरोसेंट प्रोटीन GFP द्वारा मैक्रोफेज लेबल में प्लाज्मिड इंजेक्शन. फिर, हम il34 अभिव्यक्ति के पैटर्न और संख्या या मैक्रोफेज के स्थान का पता लगाने के लिए situ संकरीकरण और इम्यूनोस्टेनिंग में पूरे माउंट फ्लोरोसेंट का इस्तेमाल किया। इंजेक्शन WT भ्रूण एक स्थिर ट्रांसजेनिक लाइन उत्पन्न करने के लिए उठाया गया था. इन चरणों में, हमने साइटोकिन-उत्पादक लाइन की स्थापना की और उसे मान्य किया और मैक्रोफेज वितरण पर देखे जा सकने वाले प्रभावों का दृष्टिसे मूल्यांकन किया. अंत में, साइटोकाइन के प्रत्युत्तर में मैक्रोफेज व्यवहार की जांच करने के लिए, हमने विवो में मैक्रोफेज प्रवास पर il34 के कार्य की पुष्टि करने के लिए सीधे मैक्रोफेज माइग्रेशन का निरीक्षण करने के लिए confocal लाइव इमेजिंग का उपयोग किया।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल हमें मैक्रोफेजिन विवो के व्यवहार पर एक chemokine के समारोह की जांच करने की अनुमति देता है और प्रक्रिया कुछ तकनीकी विशेषज्ञता की आवश्यकता है. सारांश में, प्रोटोकॉल में जटिलताओं से बचने …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम Tg (fabp10a: DsRed) ट्रांसजेनिक लाइन साझा करने के लिए डॉ Jingrong पेंग धन्यवाद; Tg (mpeg1: GFP) ट्रांसजेनिक लाइनों को साझा करने के लिए डॉ जिलोंग वेन; pTol2 वेक्टर प्रदान करने के लिए डॉ कोइची Kawakami. यह काम चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31771594), गुआंग्डोंग विज्ञान और प्रौद्योगिकी योजना परियोजनाओं (2019A030317001) और केंद्रीय विश्वविद्यालयों के लिए मौलिक अनुसंधान कोष (D2191450) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Antibody | |||
| Alexa 488-Anti-Goat antibody | Invitrogen | A11055 | |
| Anti-Digoxigenin-HRP | perkinelmer | NEF832001EA | |
| Goat-Anti-GFP antibody | Abcam | ab6658 | |
| Reagent | |||
| CaCl2· 2H2O | Sigma | 21097 | |
| Cyanine 3 Plus Amplification Reagent | perkinelmer | NEL745001KT | |
| E2 solution | 15 mM NaCl +0.5 mM KCl +1.0 mM MgSO4+150 µM KH2PO4 + 50 µM Na2HPO4 +1.0 mM CaCl2 + 0.7 mM NaHCO3 | ||
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Life | 10099-133 | |
| formamide | Diamond | A100314 | |
| glycerol | Sigma | V900860 | |
| heparin sodium | Sigma | H3149 | |
| hybridization buffer(HB) | 50% formamide+ 5×SSC+9 mM sodium citrate+50 μg/ml heparin sodium+ 500 μg/ml tRNA+ 0.1% Tween20 | ||
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| low melting agarose | Sigma | A9414 | |
| methanol | GHTECH | 1.17112.023 | |
| methylene blue | Sigma | M9140 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S5136 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| paraformaldehyde(PFA) | Sigma | 158127 | Suspend 16 g of PFA in 400 ml of 1x PBS, heat at 60 °C to dissolve about 30 min. This solution can be prepared in advance and stored at -4 °C. Caution. Manipulate with mask. |
| 10×PBS | 14.2 g Na2HPO4+80 g NaCl+2 g KCl+ 2.4 g KH2PO4 in 1L ddH2O | ||
| phenylthiourea(PTU) | Sigma | P7629 | |
| 1×Plus Amplification Diluent | perkinelmer | NEL745001KT | |
| Proteinase K | Fermentas | E00492 | |
| 20×Saline sodium citrate(SSC) | 175.3 g NaCl+ 88.2 g sodium citrate in 1 L ddH2O, PH 7.0 | ||
| sodium citrate | Sigma | A5040 | |
| tricaine | Sigma | E10521 | |
| tRNA | Sigma | R6625 | |
| Tween20 | Sigma | P2287 | |
| Plasmid | |||
| pBLK-fabp10a-il34-sv40 | For Tg (fab10a:il34) transgenic line generation | ||
| pBSK-il34 | For il34 probe preparation | ||
| Fish | |||
| Tg (mpeg1: GFP) | Label macrophages with GFP | ||
| Tg (fabp10a: DsRed) | Label liver cells with DsRed | ||
| Tg (fab10a:il34) | Over-expression IL-34 in liver cells |
References
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