Et svangerskap utenfor livmoren chemokine Expression modell for testing macrophage rekruttering in vivo
Summary
For å teste effekten av en chemokine på macrophage rekruttering i Vivo, ble hele Mount in situ hybridisering brukt til å påvise chemokine, og immunostaining ble brukt til å merke makrofager. Live Imaging ble brukt for sanntids observasjon av macrophage migrasjon.
Abstract
Sebrafisk er mye brukt i grunnleggende og biomedisinsk forskning. Mange sebrafisk transgene-linjer er for tiden tilgjengelige for å merke ulike typer celler. På grunn av den gjennomsiktige embryonale kroppen av sebrafisk, er det praktisk for oss å studere effekten av en chemokine på atferden til en bestemt type celler in vivo. Her har vi gitt en arbeidsflyt for å undersøke funksjonen til en chemokine på macrophage migrasjon in vivo. Vi konstruerte en vev-spesifikk overuttrykte plasmider til overekspresjon IL-34 og injisert plasmider i en celle scene transgene fisk embryo hvis makrofager var spesielt merket med et fluorescerende protein. Vi brukte deretter hele Mount fluorescerende in situ hybridisering og immunostaining å oppdage mønsteret av chemokine uttrykk og antall eller plassering av makrofager. Den injisert WT embryo ble hevet for å generere en stabil transgene linje. Til slutt brukte vi konfokalmikroskopi Live Imaging å direkte observere macrophage atferd i stallen transgene fisk å studere funksjonen til IL-34 på makrofager in vivo.
Introduction
Sebrafisk er en liten tropisk hard-Bones ferskvannsfisk oppsto i India. Når det gjelder gen bevaring, sebrafisk har en likhet med 87% til den menneskelige1. Det kan gi oss innsikt i beslektede emner av menneskelig ved å studere gen regulering, protein funksjon og celle atferd som migrasjon, spredning et.al i sebrafisk. Sebrafisk embryo kan brukes til å observere utviklingen av tidlig embryo på ulike stadier etter hemme pigment. I mellomtiden tar det bare tre måneder for sebrafisk å utvikle seg til seksuell modenhet, så sebrafisk kan produsere hundrevis av egg hver 4 dager. Mini-størrelse, enkel avl, sterk reproduktiv kapasitet, disse fordelene gjør sebrafisk kultur svært plassbesparende, bidrar til stor skala kultur. Den tradisjonelle pattedyr modellen musen har en høyere vedlikeholdskostnader enn sebrafisk, derfor begrenser omfanget av musen øke. I det aspektet av tidlig embryoutvikling, mus embryo er vanskelig å observere i live tilstand på grunn av egenskapene til musen embryoutvikling i mors liv. Tvert imot, sebrafisk embryo utvikles eksternt og er gjennomsiktige, derfor er de enkle å observere under et mikroskop. Videre er sebrafisk veldig lett å konstruere en rekke transgene linjer for relatert gen funksjon forskning. For tiden er ulike sebrafisk transgene Lines tilgjengelige for å merke ulike typer celler. Det er veldig praktisk nå å konstruere transgene Lines å overekspresjon chemokiner på bestemte steder og studere chemokiner funksjon på celle atferd i sebrafisk.
Her ga vi en arbeidsflyt for å bruke sebrafisk transgene line for å undersøke funksjonen til Il-34 om macrophage adferd i vivo2,3,4,5,6,7. For det første konstruerte vi en lever spesifikk overuttrykte plasmider av genet il34 og injisert plasmider i en-celle scene TG (MPEG1: GFP) fiske embryo som spesielt merket makrofager av fluorescerende protein GFP. Deretter brukte vi hele Mount fluorescerende in situ hybridisering og immunostaining å oppdage mønsteret av il34 uttrykk og antall eller plassering av makrofager. Den injisert WT embryo ble hevet for å generere en stabil transgene linje. I disse trinnene etablerte og validerte vi den cytokin linjen og vurderte effekten visuelt som kan ses på macrophage fordeling. Til slutt, for å undersøke macrophage adferd som svar på cytokin, brukte vi konfokalmikroskopi Live Imaging til direkte å observere macrophage migrasjon for å bekrefte funksjonen til il34 på macrophage migrasjon in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen er beskrevet her tillater oss å undersøke funksjonen av en chemokine på atferden til macrophagein vivo og prosedyren krever noen teknisk ekspertise. Oppsummert er det flere viktige skritt for å unngå komplikasjoner i protokollen: 1) Velg en passende transgene linje som viser spesifikt og sterkt transgene signal for å merke cellen av interesse; 2) Velg et passende vev som er tilgjengelig for bildebehandling og transgene gen overuttrykte; 3) lage en sensitiv og spesifikk RNA-sonde; 4) Velg et passende obs…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Jingrong Peng for deling av TG (fabp10a: DsRed) transgene line; Dr. Zilong Wen for deling av TG (MPEG1: GFP) transgene Lines; Dr. Koichi Kawakami for å gi pTol2 vektor. Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation i Kina (31771594), Guangdong Science and Technology plan prosjekter (2019A030317001) og grunnleggende Research Funds for Central universiteter (D2191450).
Materials
| Antibody | |||
| Alexa 488-Anti-Goat antibody | Invitrogen | A11055 | |
| Anti-Digoxigenin-HRP | perkinelmer | NEF832001EA | |
| Goat-Anti-GFP antibody | Abcam | ab6658 | |
| Reagent | |||
| CaCl2· 2H2O | Sigma | 21097 | |
| Cyanine 3 Plus Amplification Reagent | perkinelmer | NEL745001KT | |
| E2 solution | 15 mM NaCl +0.5 mM KCl +1.0 mM MgSO4+150 µM KH2PO4 + 50 µM Na2HPO4 +1.0 mM CaCl2 + 0.7 mM NaHCO3 | ||
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Life | 10099-133 | |
| formamide | Diamond | A100314 | |
| glycerol | Sigma | V900860 | |
| heparin sodium | Sigma | H3149 | |
| hybridization buffer(HB) | 50% formamide+ 5×SSC+9 mM sodium citrate+50 μg/ml heparin sodium+ 500 μg/ml tRNA+ 0.1% Tween20 | ||
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| low melting agarose | Sigma | A9414 | |
| methanol | GHTECH | 1.17112.023 | |
| methylene blue | Sigma | M9140 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S5136 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| paraformaldehyde(PFA) | Sigma | 158127 | Suspend 16 g of PFA in 400 ml of 1x PBS, heat at 60 °C to dissolve about 30 min. This solution can be prepared in advance and stored at -4 °C. Caution. Manipulate with mask. |
| 10×PBS | 14.2 g Na2HPO4+80 g NaCl+2 g KCl+ 2.4 g KH2PO4 in 1L ddH2O | ||
| phenylthiourea(PTU) | Sigma | P7629 | |
| 1×Plus Amplification Diluent | perkinelmer | NEL745001KT | |
| Proteinase K | Fermentas | E00492 | |
| 20×Saline sodium citrate(SSC) | 175.3 g NaCl+ 88.2 g sodium citrate in 1 L ddH2O, PH 7.0 | ||
| sodium citrate | Sigma | A5040 | |
| tricaine | Sigma | E10521 | |
| tRNA | Sigma | R6625 | |
| Tween20 | Sigma | P2287 | |
| Plasmid | |||
| pBLK-fabp10a-il34-sv40 | For Tg (fab10a:il34) transgenic line generation | ||
| pBSK-il34 | For il34 probe preparation | ||
| Fish | |||
| Tg (mpeg1: GFP) | Label macrophages with GFP | ||
| Tg (fabp10a: DsRed) | Label liver cells with DsRed | ||
| Tg (fab10a:il34) | Over-expression IL-34 in liver cells |
References
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Wang, Y., et al. IL-34 is a tissue-restricted ligand of CSF1R required for the development of Langerhans cells and microglia. Nature Immunology. 13 (8), 753-760 (2012).
- Lin, H., et al. Discovery of a cytokine and its receptor by functional screening of the extracellular proteome. Science. 320 (5877), 807-811 (2008).
- Wei, S., et al. Functional overlap but differential expression of CSF-1 and IL-34 in their CSF-1 receptor-mediated regulation of myeloid cells. Journal of leukocyte biology. 88 (3), 495-505 (2010).
- Etienne, D., Foucher, S. B. L. P., Norbert Ifrah, P. G. Y. D. IL-34 Induces the Differentiation of Human Monocytes into Immunosuppressive Macrophages. Antagonistic Effects of GM-CSF and IFNc. PLoS One. 8 (2), e56045 (2013).
- Segaliny, A. I., et al. Syndecan-1 regulates the biological activities of interleukin-34. Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (5), 1010-1021 (2015).
- Zhou, S. L., et al. miR-28-5p-IL-34-macrophage feedback loop modulates hepatocellular carcinoma metastasis. Hepatology. 63 (5), 1560-1575 (2016).
- Gordon, J. I., et al. Tissue specific expression and developmental regulation of two genes coding for rat fatty acid binding proteins. Journal of Biological Chemistry. 260 (4), 1995-1998 (1985).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish: a practical approach. , (2002).
- Jiang, Y., Chen, J., Yen, K., Xu, J. Ectopically Expressed IL-34 Can Efficiently Induce Macrophage Migration to the Liver in Zebrafish. Zebrafish. 16 (2), 165-170 (2019).
