בידוד של שלשלות חוץ-תאיות מועשרות אקסוזום הנושאות גרנולוציט-מקרופאג' גורם מעורר מושבה מתאי גזע עובריים
Summary
מחקר זה מתאר שיטה לבודד שלשולים חוץ-תאיים מועשרים אקסוזום הנושאים גורמים מעוררי גרנולוציטים מקרופטים למושבה מגרה את המעי הגס מתאי גזע עובריים.
Abstract
תאי גזע עובריים (ESCs) הם תאי גזע פלוריפוטנטיים המסוגלים להתחדשות עצמית ובידול לכל סוגי התאים העובריים. כמו סוגי תאים רבים אחרים, ESCs משחררים שלטי ממברנה קטנים, כגון אקסוזומים, לסביבה חוץ-תאית. אקסוזומים משמשים כמתווכים חיוניים של תקשורת בין-תאית וממלאים תפקיד בסיסי בתהליכים פיזיולוגיים רבים (פתולוגיים). גורם גרנולוצייט-מקרופאג’ מגרה מושבה (GM-CSF) מתפקד כציטוקין כדי לווסת את התגובה החיסונית. לנוכחות של GM-CSF באקסוזומים יש פוטנציאל להגביר את תפקוד מערכת החיסון-רגולציה שלהם. כאן, GM-CSF היה ביציבות יתר על המידה בקו תא ESC מורין ES-D3. פותח פרוטוקול לבידוד שלשלשות חוץ-תאיות (EV) מועשרות אקסוזום באיכות גבוהה מתאי ES-D3 המבישים יתר על המידה GM-CSF. רכבים אלקטרוניים מבודדים מועשרים אקסוזום התאפיינו במגוון גישות ניסיוניות. חשוב לציין, כמויות משמעותיות של GM-CSF נמצאו נוכחים ב- EVs מועשר אקסוזום. באופן כללי, EVs מועשר אקסוזום נושא GM-CSF מ- ESCs עשוי לתפקד כשלישיות ללא תאים כדי להפעיל את פעילותם החיסון-רגולטורית.
Introduction
ESCs נגזרים מהשלב הפיצוץ של עובר ההשתלה מראש1. כתאי גזע פלוריפוטנטים, ל- ESCs יש את היכולת לחדש את עצמם ולהבדיל לכל סוג של תא עוברי. בשל הפוטנציאל ההתפתחותי המדהים שלהם ויכולת שגשוג לטווח ארוך, ESCs הם בעלי ערך רב למחקר ביו-רפואי1. מאמצי המחקר הנוכחי התמקדו במידה רבה בפוטנציאל הטיפולי של ESCs למגוון הפרעות פתולוגיות עיקריות, כולל סוכרת, מחלות לב ומחלות ניווניות2,3,4.
תאי יונקים, כולל ESCs, ידועים לשחרר שלל עם גדלים משתנים לסביבה חוץ תאית, ורכבים אלקטרוניים אלה יש פונקציות פיזיולוגיות ופתולוגיות רבות בשל תפקידם בתקשורת בין תאית5. בין תת-סוגים שונים של רכבים חללית, אקסוזומים הם שלל ממברנה קטן המשתחרר מסוגי תאים שונים לחלל החוץ-תאי עם היתוך של תאים אנדוציטיים ביניים, גופים רב-לשוניים (MVB), עם קרום הפלזמה6. Exosomes דווחו לתווך תקשורת בין תאית והם מעורבים באופן קריטי בתהליכים פיזיולוגיים רבים (פאתוס)7,8. אקסוזומים יורשים כמה פונקציות ביולוגיות מתאי ההורים שלהם, כי אקסוזומים מכילים חומרים ביולוגיים שנרכשו מהציטוסול, כולל חלבונים וחומצות גרעין. לכן, האנטיגנים הקשורים או גורמים הממריצים את התגובה החיסונית הספציפית למחלה נתונה הם עטופים exosomes מסוגים מסוימים של תאים9. זה סלל את הדרך לניסויים קליניים לחקור אקסוזומים שמקורם בגידולים כחיסון נגד סרטן10.
GM-CSF הוא ציטוקינים המופרשים על ידי סוגים שונים של תאי מערכת החיסון11. ראיות המתעוררות ממחישות כי GM-CSF מפעיל ומווסת את המערכת החיסונית וממלא תפקיד חיוני בתהליך האנטיגן-הצגה12. לדוגמה, דו”ח קליני מציע כי GM-CSF מגרה את התגובה החיסונית לגידולים כאדג’ובנטחיסון 13. מספר אסטרטגיות אימונותרפיה לסרטן מבוסס GM-CSF כדי לנצל את הפעילות החיסונית החזקה של GM-CSF נחקרו בניסויים קליניים14. בין אלה, חיסון לסרטן המורכב מתאי גידול מפרישים GM-CSF מוקרן הראה הבטחה מסוימת בחולי מלנומה מתקדמים על ידי גרימת תגובות אנטיטומור תאיות והומוריסטיות ונמק לאחר מכן בגידולים גרורתיים15.
מכיוון שהאקסוזומים הנגזרים מ- ESCs הם בעלי פעילויות ביולוגיות דומות לזו של ESCs המקוריים, אולי אקסוזומים נושאי GM-CSF מ- ESCs יכולים לתפקד כשלשלות ללא תאים כדי לווסת את התגובה החיסונית. במאמר זה, מתוארת שיטה מפורטת לייצור EVs מועשר אקסוזום באיכות גבוהה מ- ESCs המבטאים GM-CSF. ל-EVs המועשרים באקסוזום יש פוטנציאל לשמש כשלפוחיות רגולטוריות של מערכת החיסון כדי לווסת את התגובה החיסונית.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחקר זה מראה שיטה יעילה ביותר לייצור EVs מועשר אקסוזום הנושא את חלבון גירוי מערכת החיסון GM-CSF, אשר ניתן להשתמש בו כדי ללמוד את ההשפעות המווסתות של מערכות הפעלה חשמליות מועשרות אקסוזום. מספר מחקרים מראים כי exosomes להפגין פונקציות חיסונית-רגולטורית ואנטי הגידול22. לפיכך, אקסוזומים מ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למר ארקדיוש סלוסרצ’יק ורשת תשתיות המחקר הביו-רפואי של קנטאקי (KBRIN, P20GM103436) על רכישת תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקים מ NIH AA018016-01 (J.W.E.), חבר העמים של קנטאקי מחקר אתגר אמון אמון (J.W.E.), NIH CA106599 ו CA175003 (C.L.), NIH CA198249 (K.Y.), וחופשי לנשום מענק מחקר (K.Y.).
Materials
| Alkaline phosphate, Calf Intestinal | New England Biolabs | M0290S | Dephosphorylating DNA plasmid |
| anti-Annexin V mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone H-3, sc-74438 | Western blot, RRID:AB_1118989 |
| anti-CD81 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone B-11, sc-166029 | Western blot, RRID:AB_2275892 |
| anti-cytochrome c mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone A-8, sc-13156 | Western blot, RRID:AB_627385 |
| anti-Flotillin-1 mAb | Santa Cruz Biotechnology | clone C-2; sc-74566 | Western blot, RRID:AB_2106563 |
| anti-GAPDH pAb | Rockland | 600-401-A33S | Western blot, RRID:AB_11182910 |
| anti-mouse IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31430 | Western blot, RRID:AB_228307 |
| anti-Oxphos COX IV-subunit IV mAb | Thermo Fisher | clone 20E8C12 A21348 | Western blot, RRID:AB_221509 |
| anti-protein disulfide isomerase (PDI) pAb | Enzo | ADI-SPA-890 | Western blot, RRID:AB_10616242 |
| anti-rabbit IgG, goat, peroxidase-conjugated | Thermo Fisher | 31460 | Western blot, RRID:AB_228341 |
| BCA (bicinchoninic acid) assay | Thermo Fisher | 23223 | Determining protein concentrations |
| Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20% | Genscript | M42015 | Western blot |
| Carbenicillin, Disodium Salt | Thermo Fisher | 10177012 | Selecting E. coli colonies |
| Centrifuge, Avanti J-26 XPI | Beckman Coulter | Low speed centrifugation | |
| Centrifuge rotor, JA-10 | Beckman Coulter | 09U1597 | Low speed centrifugation |
| Centrifuge bottle, Nalgene PPCO | Thermo Fisher | 3120-0500PK | Low speed centrifugation |
| Cu grids with carbon support film | Electron Microscopy Sciences | FF200-Cu | Acquiring electron microscopy images |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101 | Digesting DNA plasmid |
| Enhanced chemiluminescence detection system | Thermo Fisher | 32106 | Western blot |
| FACScalibur flow cytometer | Becton Dickinson | Examining GFP levels of ES-D3 cells | |
| Fetal bovine serum | ATCC | SCRR-30-2020 | Medium for ES-D3 cells |
| Fisherbrand Sterile Cell Strainers; Mesh Size: 40μm | Thermo Fisher | 22-363-547 | Filtering ES-D3 cells for FACS sorting |
| Gelatin (0.1%) | Thermo Fisher | ES006B | Culturing ES-D3 cells |
| GM-CSF ELISA kit | Thermo Fisher | 88733422 | Determining GM-CSF concentrations |
| KnockOut Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Thermo Fisher | 10-829-018 | Medium for ES-D3 cells |
| Leukemia Inhibitory Factor | Thermo Fisher | ESG1106 | Medium for ES-D3 cells |
| L-glutamine | VWR | VWRL0131-0100 | Medium for ES-D3 cells |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher | 11668019 | Transfecting ES-D3 cells |
| Microplate reader, PowerWave XS | BioTek | Determining GM-CSF concentrations | |
| MoFlo XDP high-speed cell sorter | Beckman Coulter | Isolating single ES-D3 cell clones | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England Biolabs | C2988J | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Neomycin | Thermo Fisher | 10-131-035 | Selecting ES-D3 clones |
| Non-essential amino acids | Thermo Fisher | SH3023801 | Medium for ES-D3 cells |
| Non-fat dry milk | Thermo Fisher | NC9022655 | Western blot |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 | Transfecting ES-D3 cells |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Acquiring electron microscopy images |
| Penicillin/streptomycin | VWR | sc45000-652 | Medium for ES-D3 cells |
| Plasmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFP | Addgene | 37270 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| PVDF membranes | Millipore EMD | IPVH00010 | Western blot |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | QIAGEN | 28704 | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200S | Generating GM-CSF expression plasmid |
| Transmission electron microscope | Hitachi | HT7700 | Acquiring electron microscopy images |
| Trypsin | VWR | 45000-660 | Culturing ES-D3 cells |
| Ultracentrifuge, OptimaTM L-100 XP | Beckman Coulter | High speed centrifugation | |
| Ultracentrifuge rotor, 45Ti | Beckman Coulter | 09U4454 | High speed centrifugation |
| Ultracentrifuge polycarbonate bottle | Beckman Coulter | 355622 | High speed centrifugation |
| UranyLess staining solution | Electron Microscopy Sciences | 22409 | Acquiring electron microscopy images |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Sakthiswary, R., Raymond, A. A. Stem cell therapy in neurodegenerative diseases: From principles to practice. Neural Regeneration Research. 7 (23), 1822-1831 (2012).
- Liu, Y. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates. Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).
- Aguayo-Mazzucato, C., Bonner-Weir, S. Stem cell therapy for type 1 diabetes mellitus. Nature Reviews: Endocrinology. 6 (3), 139-148 (2010).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Current Biology. 28 (8), R435-R444 (2018).
- Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles. Journal of Control Release. 244 (Pt B), 167-183 (2016).
- Lindenbergh, M. F. S., Stoorvogel, W. Antigen Presentation by Extracellular Vesicles from Professional Antigen-Presenting Cells. Annual Review of Immunology. 36, 435-459 (2018).
- Kunigelis, K. E., Graner, M. W. The Dichotomy of Tumor Exosomes (TEX) in Cancer Immunity: Is It All in the ConTEXt?. Vaccines (Basel). 3 (4), 1019-1051 (2015).
- Becher, B., Tugues, S., Greter, M. GM-CSF: From Growth Factor to Central Mediator of Tissue Inflammation. Immunity. 45 (5), 963-973 (2016).
- Conti, L., Gessani, S. GM-CSF in the generation of dendritic cells from human blood monocyte precursors: recent advances. Immunobiology. 213 (9-10), 859-870 (2008).
- Higano, C. S., et al. Integrated data from 2 randomized, double-blind, placebo-controlled, phase 3 trials of active cellular immunotherapy with sipuleucel-T in advanced prostate cancer. Cancer. 115 (16), 3670-3679 (2009).
- Yan, W. L., Shen, K. Y., Tien, C. Y., Chen, Y. A., Liu, S. J. Recent progress in GM-CSF-based cancer immunotherapy. Immunotherapy. 9 (4), 347-360 (2017).
- Dranoff, G., et al. Vaccination with irradiated tumor cells engineered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor stimulates potent, specific, and long-lasting anti-tumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (8), 3539-3543 (1993).
- Tremml, G., Singer, M., Malavarca, R. Chapter 1, Unit 1C 4, Culture of mouse embryonic stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2008).
- Kirsch, P., Hafner, M., Zentgraf, H., Schilling, L. Time course of fluorescence intensity and protein expression in HeLa cells stably transfected with hrGFP. Molecules and Cells. 15 (3), 341-348 (2003).
- Zeng, X., et al. Stable expression of hrGFP by mouse embryonic stem cells: promoter activity in the undifferentiated state and during dopaminergic neural differentiation. Stem Cells. 21 (6), 647-653 (2003).
- Yaddanapudi, K., et al. Vaccination with embryonic stem cells protects against lung cancer: is a broad-spectrum prophylactic vaccine against cancer possible?. PLoS One. 7 (7), e42289 (2012).
- Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods. 33 (2), 95-103 (2004).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Chapter 3, Unit 3 22, Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , (2006).
- Zhang, X., et al. Exosomes for Immunoregulation and Therapeutic Intervention in Cancer. Journal of Cancer. 7 (9), 1081-1087 (2016).
- Bunggulawa, E. J., et al. Recent advancements in the use of exosomes as drug delivery systems. Journal of Nanobiotechnology. 16 (1), 81 (2018).
- Schlesinger, S., Lee, A. H., Wang, G. Z., Green, L., Goff, S. P. Proviral silencing in embryonic cells is regulated by Yin Yang 1. Cell Reports. 4 (1), 50-58 (2013).
- Dranoff, G. GM-CSF-based cancer vaccines. Immunological Reviews. 188, 147-154 (2002).
- Park, Y. G., et al. Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In Vitro. Development and Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).
- Lin, S., Talbot, P. Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells. Methods in Molecular Biology. 690, 31-56 (2011).
- Yaddanapudi, K., et al. Exosomes from GM-CSF expressing embryonic stem cells are an effective prophylactic vaccine for cancer prevention. OncoImmunology. 8 (3), 1561119 (2019).
