Løsning af vand, proteiner og lipider fra in vivo Confocal Raman Spectra af stratum corneum gennem en Kemometrisk tilgang
Summary
Her præsenterer vi en protokol for indsamling af konfokale Raman Spectra fra mennesker i kliniske studier kombineret med chemometriske tilgange til spektral outlier fjernelse og den efterfølgende udvinding af nøglefunktioner.
Abstract
Udvikling af denne in vivo konfokale Raman spektroskopiske metode muliggør direkte måling af vand, proteiner og lipiderne med dybde opløsning hos mennesker. Disse oplysninger er meget vigtige for hudrelaterede sygdomme og kendetegner hudpleje produktets ydeevne. Denne protokol illustrerer en metode til Konfokal Raman Spectra kollektion og den efterfølgende analyse af spektral datasæt, der udnytter chemometrics. Formålet med denne metode er at etablere en standardprotokol for dataindsamling og give generelle retningslinjer for dataanalyse. Forbehandling (f. eks. fjernelse af outlier Spectra) er et afgørende skridt ved behandling af store datasæt fra kliniske studier. Som et eksempel giver vi vejledning baseret på forudgående kendskab til et datasæt for at identificere typerne af afvigende værdier og udvikle specifikke strategier til at fjerne dem. Der udføres en hovedkomponent analyse, og belastnings spektrene sammenlignes med spektre fra referencematerialer for at vælge det antal komponenter, der anvendes i den endelige multivariat kurve opløsning (MCR)-analyse. Denne fremgangsmåde er vellykket til udvinding af meningsfulde oplysninger fra et stort spektral datasæt.
Introduction
I kliniske studier har in vivo konfokale Raman spectroskopi vist sin unikke evne til at bestemme stratum corneum tykkelse og vandindhold1,2,3,4, og spore penetration af aktive materialer topisk påføres huden5,6. Som en ikke-invasiv tilgang detekterer konfokale Raman spectroskopi molekylære signaler baseret på vibrationelle tilstande. Således, mærkning er ikke nødvendig7. In vivo konfokale Raman spectroskopi giver kemisk information med dybde opløsning baseret på den konfokale karakter af teknikken. Denne dybde-afhængige oplysninger er meget nyttigt i at studere virkningerne af hudplejeprodukter4,8, aging9,10, sæson ændringer3, samt hud barriere funktion sygdomme, såsom atopisk dermatitis11,12. Der er en masse information i højfrekvens regionen af konfokale Raman spektroskopi (2500 – 4000 cm-1), hvor vand producerer forskellige toppe i regionen mellem 3250-3550 cm-1. Raman toppe af proteiner og lipider, som er centreret mellem ca. 2800-3000 cm-1, overlapper hinanden, fordi signalerne hovedsageligt produceres fra methylen (-CH2-) og methyl (-CH3) grupper13 . Disse overlappende oplysninger udgør en teknisk udfordring ved opnåelse af relative mængder af individuelle molekylære arter. Topmontering14,15 og selektiv peak position12,16 tilgange er blevet brugt til at løse denne udfordring. Men, det er vanskeligt for disse enkelt peak-baserede metoder til at udtrække ren komponentoplysninger, fordi flere Raman toppe fra samme komponent ændring samtidig17. I vores nylige publikation18blev en MCR-tilgang foreslået for at belyse den rene komponent information. Ved hjælp af denne fremgangsmåde blev tre komponenter (vand, proteiner og lipider) udvundet fra et stort in vivo konfokale Raman spektroskopisk datasæt.
Gennemførelsen af store kliniske undersøgelser kan være krævende for enkeltpersoner at indsamle in vivo spektroskopiske data. I nogle tilfælde kan spektral erhvervelse kræve driftsudstyr i mange timer på en dag, og undersøgelsen kan strække sig op til uger eller måneder. Under disse omstændigheder kan spektroskopiske data genereres af udstyrs operatører, der mangler den tekniske ekspertise til at identificere, udelukke og korrigere for alle kilder til spektroskopiske artefakter. Det resulterende datasæt kan indeholde en lille brøkdel af spektroskopiske afvigende værdier, som skal identificeres og udelukkes fra data forud for analysen. Dette papir illustrerer i detaljer en chemometrisk analyse proces for at “rydde op” et klinisk Raman datasæt, før du analyserer data med MCR. For at kunne fjerne outliers, skal typerne af afvigende værdier og den potentielle årsag til genereringen af outlier Spectra identificeres. Derefter, en specifik tilgang kan udvikles til at fjerne de målrettede outliers. Dette kræver forudgående kendskab til datasættet, herunder en detaljeret forståelse af datagenererings processen og undersøgelsens design. I dette datasæt er størstedelen af afvigende værdier lav signal-til-støj-spektre og stammer primært fra 1) spektre indsamlet over hudens overflade (6.208 ud af 30.862) og 2) stærkt bidrag til spektret fra fluorescerende rum-lys (67 ud af 30.862). Spektre indsamlet over hudens overflade giver et svagt Raman-respons, da laser brændpunktet nærmer sig hudens overflade og er for det meste i instrument vinduet under huden. Spectra med et stærkt bidrag fra fluorescerende rum lys genereres på grund af enten instrument operatør fejl eller motiv bevægelse, som frembringer en tilstand, hvor konfokale Raman Collection vinduet ikke er fuldt dækket af motivet krop site. Selv om disse typer af spektral artefakter kunne identificeres og aflæres under spektral erhvervelse af en spektroskopisk ekspert på tidspunktet for dataindsamlingen, blev de uddannede instrument operatører, der anvendes i dette studie, instrueret om at indsamle alle data, medmindre en katastrofale svigt blev observeret. Opgaven med at identificere og udelukke afvigende værdier er indarbejdet i dataanalyse protokollen. Den forelagte protokol er udarbejdet for at løse denne udfordring. For at adressere det lave signal-til-støj-spektre over hudoverfladen skal placeringen af hudens overflade bestemmes først for at tillade fjernelse af spektre indsamlet over hudens overflade. Placeringen af hudens overflade defineres som dybden, hvor Raman laser brændpunktet er halvt i huden og halvt ud af huden som illustreret i supplerende figur 1. Efter fjernelse af lav signal-støj-spektre, en hovedkomponent analyse (PCA) er implementeret for at udtrække den faktor domineret af fluorescerende rum lys toppe. Disse afvigende værdier fjernes baseret på score værdien af den tilsvarende faktor.
Denne protokol indeholder detaljerede oplysninger om, hvordan seks hovedkomponenter bestemmes i MCR-processen. Dette sker gennem en PCA-analyse efterfulgt af spektral form sammenligning mellem belastningerne for modeller genereret med et forskelligt antal hovedkomponenter. Den eksperimentelle proces for dataindsamling af referencematerialer samt de menneskelige er også forklaret i detaljer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Under dataindsamlingen, som beskrevet i afsnit 2 og 3 i protokollen, blev hver dybde profil indsamlet i et område med kontakt mellem instrument vinduet og huden ved at finde de mørkere områder fra de mikroskopiske billeder, der er fremhævet i de røde cirkler i Figur 2C. Når disse områder var placeret, det var vigtigt at starte dybden profil over hudens overflade til præcist at bestemme placeringen af hudens overflade for dataanalyse procedure. Placeringen af hudover…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkender i høj grad den finansielle støtte fra corporate funktion analytisk og personlig udrensning Care afdeling. Vi ønsker at udtrykke vores taknemmelighed over for analytiske associerede direktører MS Jasmine Wang og Dr. Robb Gardner for deres vejledning og støtte og MS Li Yang for hendes hjælp på dataindsamling.
Materials
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol 3-sulfate sodium | Sigma-Aldrich | ||
| D-Erythro-Dihydrosphingosine | Sigma-Aldrich | ||
| DI water | Purified with Milipore(18.2MΩ) | ||
| Gen2-SCA skin analyzer | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | Gen2 | |
| Matlab 2018b | Mathwork | 2018b | |
| N-behenoyl-D-erythro-sphingosine | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| N-Lignoceroyl-D-erythro-sphinganine(ceramide) | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitoleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| PLS_Toolbox version 8.2 | Eigenvector Research Inc. | 8.2 | |
| RiverICon | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | version 3.2 | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | ||
| Stearic Acid | Sigma-Aldrich |
References
- Caspers, P., Lucassen, G., Bruining, H., Puppels, G. Automated depth – scanning confocal Raman microspectrometer for rapid in vivo determination of water concentration profiles in human skin. Journal of Raman Spectroscopy. 31 (8-9), 813-818 (2000).
- Crowther, J., et al. Measuring the effects of topical moisturizers on changes in stratum corneum thickness, water gradients and hydration in vivo. British Journal of Dermatology. 159 (3), 567-577 (2008).
- Egawa, M., Tagami, H. Comparison of the depth profiles of water and water-binding substances in the stratum corneum determined in vivo by Raman spectroscopy between the cheek and volar forearm skin: effects of age, seasonal changes and artificial forced hydration. British Journal of Dermatology. 158 (2), 251-260 (2008).
- Crowther, J. M., Matts, P. J., Kaczvinsky, J. R. . Changes in Stratum Corneum Thickness, Water Gradients and Hydration by Moisturizers. , (2012).
- Pudney, P. D., Mélot, M., Caspers, P. J., Van, D. P. A., Puppels, G. J. An in vivo confocal Raman study of the delivery of trans retinol to the skin. Applied Spectroscopy. 61 (8), 804 (2007).
- Mohammed, D., Matts, P., Hadgraft, J., Lane, M. In vitro-in vivo correlation in skin permeation. Pharmaceutical Research. 31 (2), 394-400 (2014).
- Hanlon, E., et al. Prospects for in vivo Raman spectroscopy. Physics in Medicine and Biology. 45 (2), 1 (2000).
- Mohammed, D., Crowther, J. M., Matts, P. J., Hadgraft, J., Lane, M. E. Influence of niacinamide containing formulations on the molecular and biophysical properties of the stratum corneum. International Journal of Pharmaceutics. 441 (1-2), 192-201 (2013).
- Boireau-Adamezyk, E., Baillet-Guffroy, A., Stamatas, G. Age-dependent changes in stratum corneum barrier function. Skin Research and Technology. 20 (4), 409-415 (2014).
- Pezzotti, G., et al. Raman spectroscopy of human skin: looking for a quantitative algorithm to reliably estimate human age. Journal of Biomedical Optics. 20 (6), 065008 (2015).
- Mlitz, V., et al. Impact of filaggrin mutations on Raman spectra and biophysical properties of the stratum corneum in mild to moderate atopic dermatitis. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 26 (8), 983-990 (2012).
- Janssens, M., et al. Lipid to protein ratio plays an important role in the skin barrier function in patients with atopic eczema. British Journal of Dermatology. 170 (6), 1248-1255 (2014).
- Faiman, R., Larsson, K. Assignment of the C H stretching vibrational frequencies in the Raman spectra of lipids. Journal of Raman Spectroscopy. 4 (4), 387-394 (1976).
- Edwards, H. G., Farwell, D. W., Williams, A. C., Barry, B. W., Rull, F. Novel spectroscopic deconvolution procedure for complex biological systems: vibrational components in the FT-Raman spectra of ice-man and contemporary skin. Journal of the Chemical Society, Faraday Transactions. 91 (21), 3883-3887 (1995).
- Choe, C., Lademann, J., Darvin, M. E. Lipid organization and stratum corneum thickness determined in vivo in human skin analyzing lipid-keratin peak (2820-3030 cm- 1) using confocal Raman microscopy. Journal of Raman Spectroscopy. 47 (11), 1327-1331 (2016).
- Stamatas, G. N., de Sterke, J., Hauser, M., von Stetten, O., van der Pol, A. Lipid uptake and skin occlusion following topical application of oils on adult and infant skin. Journal of Dermatological Science. 50 (2), 135-142 (2008).
- Choe, C., Lademann, J., Darvin, M. E. Confocal Raman microscopy for investigating the penetration of various oils into the human skin in vivo. Journal of Dermatological Science. , (2015).
- Zhang, L., et al. A MCR approach revealing protein, water and lipid depth profile in atopic dermatitis patients’ stratum corneum via in vivo confocal Raman spectroscopy. Analytical Chemistry. , (2019).
- Caspers, P. J. . In vivo Skin Characterization by Confocal Raman Microspectroscopy. , (2003).
- Jaumot, J., de Juan, A., Tauler, R. MCR-ALS GUI 2.0: New features and applications. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 140, 1-12 (2015).
- Choe, C., Choe, S., Schleusener, J., Lademann, J., Darvin, M. E. Modified normalization method in in vivo stratum corneum analysis using confocal Raman microscopy to compensate nonhomogeneous distribution of keratin. Journal of Raman Spectroscopy. , (2019).
- Wise, B. M., et al. Chemometrics tutorial for PLS_Toolbox and Solo. Eigenvector Research, Inc. 3905, 102-159 (2006).
