Résoudre l'eau, les protéines et les lipides d'In Vivo Confocal Raman Spectra de Stratum Corneum par une approche chimiométrique
Summary
Ici, nous présentons un protocole pour la collecte des spectres raman confocals des sujets humains dans les études cliniques combinées avec des approches chimiométriques pour l’ablation spectrale et l’extraction ultérieure des dispositifs principaux.
Abstract
Le développement de cette méthode spectroscopique in vivo confocale Raman permet la mesure directe de l’eau, des protéines et des lipides avec une résolution de profondeur chez les sujets humains. Cette information est très importante pour les maladies liées à la peau et la caractérisation des performances des produits de soins de la peau. Ce protocole illustre une méthode de collecte de spectres Raman confocalete et l’analyse ultérieure du jeu de données spectrale tirant parti de la chimiométrie. L’objectif de cette méthode est d’établir un protocole standard pour la collecte de données et de fournir des orientations générales pour l’analyse des données. Le prétraitement (p. ex., suppression des spectres aberrants) est une étape critique dans le traitement de grands ensembles de données provenant d’études cliniques. À titre d’exemple, nous fournissons des conseils basés sur la connaissance préalable d’un ensemble de données pour identifier les types d’valeurs aberrantes et élaborer des stratégies spécifiques pour les supprimer. Une analyse principale des composants est effectuée, et les spectres de chargement sont comparés aux spectres des matériaux de référence pour sélectionner le nombre de composants utilisés dans l’analyse finale de la résolution de la courbe multivariée (MCR). Cette approche est efficace pour extraire des informations significatives à partir d’un large jeu de données spectrales.
Introduction
Dans les études cliniques, la spectroscopie in vivo confocale de Raman a montré sa capacité unique pour déterminer l’épaisseur et la teneur en eau de corneum de strate1,2,3,4, et le suivi de la pénétration de matériaux actifs appliqués topiquement sur la peau5,6. Comme approche non invasive, la spectroscopie raman confocale détecte les signaux moléculaires basés sur les modes vibratoires. Ainsi, l’étiquetage n’est pas nécessaire7. La spectroscopie in vivo confocale de Raman fournit des informations chimiques avec une résolution de profondeur basée sur la nature confocale de la technique. Cette information de profondeur-dépendante est très utile en étudiant les effets des produits de soin de peau4,8, vieillissement9,10, changements saisonniers3, ainsi que les maladies de fonction de barrière de peau, comme la dermatite atopique11,12. Il y a beaucoup d’informations dans la région à haute fréquence de la spectroscopie raman confocale (2 500 à 4 000 cm-1), où l’eau produit des pics distincts dans la région entre 3 250 et 3 550 cm-1. Cependant, les pics Raman de protéines et de lipides, qui sont centrés entre environ 2 800 et 3 000 cm-1, se chevauchent parce que les signaux sont principalement produits à partir de méthylène (-CH2-) et de méthyle (-CH3) groupes13 . Cette information qui se chevauche présente un défi technique lors de l’obtention de quantités relatives d’espèces moléculaires individuelles. Le pic14,15 et la position de pointe sélective12,16 approches ont été utilisées pour résoudre ce défi. Cependant, il est difficile pour ces méthodes basées sur le pic unique d’extraire des informations sur les composants purs parce que plusieurs pics Raman à partir du même composant changent simultanément17. Dans notre publication récente18, une approche MCR a été proposée pour élucider l’information sur les composants purs. Grâce à cette approche, trois composants (eau, protéines et lipides) ont été extraits d’un grand ensemble de données spectroscopiques confocales de Raman in vivo.
L’exécution de grandes études cliniques peut être exigeante sur les individus recueillant des données spectroscopiques in vivo. Dans certains cas, l’acquisition spectrale peut nécessiter de l’équipement d’exploitation pendant de nombreuses heures dans une journée et l’étude peut s’étendre jusqu’à des semaines ou des mois. Dans ces conditions, les données spectroscopiques peuvent être générées par des opérateurs d’équipement qui n’ont pas l’expertise technique nécessaire pour identifier, exclure et corriger toutes les sources d’artefacts spectroscopiques. L’ensemble de données qui en résulte peut contenir une petite fraction des valeurs aberrantes spectroscopiques qui doivent être identifiées et exclues des données avant l’analyse. Cet article illustre en détail un processus d’analyse chimiométrique pour « nettoyer » un jeu de données clinique de Raman avant d’analyser les données avec MCR. Pour réussir à supprimer les valeurs aberrantes, les types de valeurs aberrantes et la cause potentielle de la génération des spectres aberrants doivent être identifiés. Ensuite, une approche spécifique peut être développée pour supprimer les valeurs aberrantes ciblées. Cela nécessite une connaissance préalable de l’ensemble de données, y compris une compréhension détaillée du processus de génération de données et de la conception de l’étude. Dans cet ensemble de données, la majorité des valeurs aberrantes sont des spectres de faible signal au bruit et proviennent principalement de 1) spectres recueillis au-dessus de la surface de la peau (6 208 sur 30 862), et 2) une forte contribution au spectre de la lumière fluorescente de la pièce (67 sur 30 862). Les spectres recueillis au-dessus de la surface de la peau produisent une faible réponse Raman, car le point focal laser s’approche de la surface de la peau et se trouve principalement dans la fenêtre de l’instrument sous la peau. Spectra avec une forte contribution de la lumière de pièce fluorescente sont générés en raison de l’erreur de l’opérateur d’instrument ou le mouvement du sujet, ce qui produit une condition où la fenêtre de collecte raman confocale n’est pas entièrement couverte par le site du corps du sujet. Bien que ces types d’artefacts spectraux aient pu être identifiés et assainis lors de l’acquisition spectrale par un expert spectroscopique au moment de l’acquisition de données, les opérateurs d’instruments formés utilisés dans cette étude ont reçu l’instruction de recueillir toutes les données à moins qu’un une défaillance catastrophique a été observée. La tâche d’identifier et d’exclure les valeurs aberrantes est intégrée au protocole d’analyse des données. Le protocole présenté est élaboré pour résoudre ce défi. Pour s’attaquer aux spectres de faible signal au bruit au-dessus de la surface de la peau, l’emplacement de la surface de la peau doit d’abord être déterminé pour permettre l’élimination des spectres recueillis au-dessus de la surface de la peau. L’emplacement de la surface de la peau est défini comme la profondeur où le point focal laser Raman est la moitié dans la peau et la moitié de la peau comme illustré dans la figure supplémentaire 1. Après avoir supprimé les spectres signal-bruit bas, une analyse principale des composants (PCA) est mise en œuvre pour extraire le facteur dominé par les pics fluorescents de lumière ambiante. Ces valeurs aberrantes sont supprimées en fonction de la valeur de score du facteur correspondant.
Ce protocole fournit des renseignements détaillés sur la façon dont six composantes principales sont déterminées dans le processus de RMC. Cela se fait au moyen d’une analyse PCA suivie d’une comparaison spectrale des formes entre les charges des modèles générés avec un nombre différent de composants principaux. Le processus expérimental de collecte de données de matériaux de référence ainsi que les sujets humains est également expliqué en détail.
Protocol
Representative Results
Discussion
Au cours de la collecte de données, telle que décrite dans les sections 2 et 3 du protocole, chaque profil de profondeur a été recueilli dans une zone avec contact entre la fenêtre de l’instrument et la peau en trouvant les zones les plus sombres des images microscopiques mises en évidence dans les cercles rouges dans Figure 2C. Une fois que ces zones ont été localisées, il était essentiel de commencer le profil de profondeur au-dessus de la surface de la peau pou…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs reconnaissent grandement le soutien financier du service d’analyse de la fonction corporative et du service de nettoyage personnel. Nous tenons à exprimer notre gratitude aux directeurs associés analytiques Mme Jasmine Wang et Dr Robb Gardner pour leurs conseils et leur soutien et à Mme Li Yang pour son aide sur la collecte de données.
Materials
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol 3-sulfate sodium | Sigma-Aldrich | ||
| D-Erythro-Dihydrosphingosine | Sigma-Aldrich | ||
| DI water | Purified with Milipore(18.2MΩ) | ||
| Gen2-SCA skin analyzer | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | Gen2 | |
| Matlab 2018b | Mathwork | 2018b | |
| N-behenoyl-D-erythro-sphingosine | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| N-Lignoceroyl-D-erythro-sphinganine(ceramide) | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitoleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| PLS_Toolbox version 8.2 | Eigenvector Research Inc. | 8.2 | |
| RiverICon | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | version 3.2 | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | ||
| Stearic Acid | Sigma-Aldrich |
References
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