פתרון מים, חלבונים ושומנים מ ב Vivo Confocal ראמאן ספקטרום של שכבה הקרנית באמצעות גישה כימומטרית
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור אוסף של מוקד ראמאן ספקטרום מן הנושאים האנושיים במחקרים קליניים בשילוב עם גישות כימומטרי עבור הסרת ספקטרליר להסרת ואת החילוץ הבא של תכונות מפתח.
Abstract
פיתוח זה ב vivo קונפוקלית וקד ראמאן הספקטרוסקופית השיטה מאפשרת מדידה ישירה של מים, חלבונים, ושומנים עם רזולוציה עומק בנושאים אנושיים. מידע זה חשוב מאוד למחלות הקשורות לעור ולאפיון ביצועי מוצר לטיפוח העור. פרוטוקול זה ממחיש שיטה לאוסף ראמאן ספקטרום מוקד ואת הניתוח הבא של ערכת הנתונים ספקטרלית מינוף כימומטריקה. מטרת שיטה זו היא ליצור פרוטוקול סטנדרטי עבור איסוף נתונים ולספק הדרכה כללית לניתוח נתונים. עיבוד מקדים (למשל, הסרת ספקטרום חריג חשוד טעות) הוא צעד קריטי בעת עיבוד ערכות נתונים גדולים ממחקרים קליניים. כדוגמה, אנו מספקים הנחיה המבוססת על ידע מוקדם של ערכת נתונים כדי לזהות את סוגי הoutliers ולפתח אסטרטגיות ספציפיות כדי להסירם. מבוצעת ניתוח של רכיב ראשי, וספקטרום הטעינה מושווה לספקטרום מחומרי התייחסות כדי לבחור את מספר הרכיבים המשמשים בניתוח רזולוציית עקומת העקומות הסופית (MCR). גישה זו מוצלחת להפקת מידע משמעותי מערכת נתונים ספקטרלית גדולה.
Introduction
במחקרים קליניים, ב vivo קונפוקלית ראמאן ספקטרוסקופית הראה את היכולת הייחודית שלה לקביעת שכבה עובי של הקרנית ותוכן מים1,2,3,4, מעקב אחר חדירת חומרים פעילים למריחה על העור,5,6. כגישה שאינה פולשנית, ספקטרוסקופיית ראמאן מזהה אותות מולקולריים המבוססים על מצבי רטט. לכן, אין צורך בתוויות7. ב vivo קונפוקלית וקד ראמאן ספקטרוסקופית מספק מידע כימי עם רזולוציה עומק מבוסס על האופי הקונקמוקד של הטכניקה. מידע זה תלוי עומק שימושי מאוד ללמוד את ההשפעות של מוצרי טיפוח העור4,8, הזדקנות9,10, שינויים עונתיים3, כמו גם מכשול העור פונקציה מחלות, כגון אטופיק דרמטיטיס11,12. יש הרבה מידע באזור בתדר גבוה של מיקוד ראמאן (2500 – 4000 ס”מ-1), שם המים מייצרת פסגות נפרדות באזור בין 3250 – 3550 ס”מ-1. עם זאת, פסגות ראמאן של חלבונים ושומנים, אשר ממורכזים בין כ 2800 – 3000 ס”מ-1, חופפים זה לזה כי האותות מיוצרים בעיקר מ מתילן (-ch2-) ו מתיל (-ch3) קבוצות13 . מידע חופף זה מציג אתגר טכני בעת קבלת כמויות יחסיות של מינים מולקולריים בודדים. התאמת שיא14,15 ו שיא סלקטיבי מיקום12,16 גישות שימשו כדי לפתור את האתגר הזה. עם זאת, קשה לשיטות מבוססות-שיא אלה לחלץ מידע של רכיבים טהורים משום שפסגות ראמאן מרובות משינוי אותו רכיב בו17. בפרסום האחרון שלנו18, הציעו גישת mcr להבהיר את מידע הרכיבים הטהורים. באמצעות גישה זו, שלושה מרכיבים (מים, חלבונים, ושומנים) חולצו מ vivo קונפוקלית וקד הנתונים הספקטרוסקופית ראמאן.
ההוצאה להורג של מחקרים קליניים גדולים יכול להיות תובעני על אנשים האוספים נתונים vivo ספקטרוסקופיים. במקרים מסוימים, רכישה ספקטרלית יכולה לדרוש ציוד הפעלה במשך שעות רבות ביום והמחקר יכול להאריך עד שבועות או חודשים. בתנאים אלה, נתונים ספקטרוסקופיים עשויים להיווצר על ידי מפעילי ציוד כי חוסר המומחיות הטכנית לזהות, לכלול, ונכון עבור כל המקורות של ממצאים ספקטרוסקופיים. ערכת הנתונים שתיווצר עשויה להכיל חלק קטן מהמידע הספקטרוסקופי הדרוש לזיהוי ולהוצאה מהנתונים לפני הניתוח. נייר זה ממחיש בפרוטרוט תהליך ניתוח כימומטרי כדי “לנקות” ערכת נתונים של ראמאן קלינית לפני ניתוח הנתונים עם MCR. כדי להסיר בהצלחה את החלק החיצוני, את סוגי המיירס ואת הסיבה הפוטנציאלית עבור הדור של ספקטרום outliers צריך להיות מזוהה. אז, גישה מסוימת ניתן לפתח כדי להסיר את היעד המיועד. זה דורש ידע מוקדם של הנתונים, כולל הבנה מפורטת על תהליך יצירת הנתונים ועיצוב המחקר. בערכת נתונים זו, רוב המכריע של החוצה הם האותות האות אל הרעש, מקורם בעיקר 1) ספקטרום שנאסף מעל פני העור (6,208 מתוך 30,862), ו 2) תרומה חזקה לספקטרום של אור בחדר פלורסנט (67 מתוך 30,862). ספקטרה נאסף מעל פני השטח העור לייצר תגובה ראמאן חלשה, כמו נקודת מוקד לייזר מתקרב למשטח העור הוא בעיקר בחלון המכשיר מתחת לעור. ספקטרה עם תרומה חזקה של אור בחדר הפלורסנט נוצרות עקב שגיאה או אופרטור המכשיר או התנועה הנושא, אשר מייצרת מצב שבו חלון אוסף ראמאן מוקד לא מכוסה במלואו על ידי אתר הגוף של הנושא. למרות סוגים אלה של ממצאים ספקטרלים יכול להיות מזוהה לתיקון במהלך רכישת ספקטרלי על ידי מומחה ספקטרוסקופי בזמן רכישת נתונים, מפעילי כלי מיומן המשמשים במחקר זה הונחו לאסוף את כל הנתונים אלא אם כן כישלון קטסטרופלי נצפתה. המשימה לזיהוי וללא כלילת החוצה משולבת בפרוטוקול ניתוח הנתונים. הפרוטוקול שהוצג פותח כדי לפתור את האתגר הזה. כדי לטפל בספקטרום של האות לרעש הנמוך מעל פני העור, המיקום של משטח העור צריך להיקבע תחילה כדי לאפשר הסרה של ספקטרום שנאסף מעל פני השטח של העור. מיקומו של משטח העור מוגדר כמו עומק שבו נקודת מוקד לייזר ראמאן הוא חצי בעור וחצי מתוך העור כפי שמודגם באיור המשלים 1. לאחר הסרת ספקטרום של אות לרעש נמוך, ניתוח מרכיב ראשי (PCA) מיושם כדי לחלץ את הפקטור הנשלט על ידי פסגות אור בחדר פלורסנט. מיירס זה מוסרים על בסיס ערך הניקוד של הפקטור המקביל.
פרוטוקול זה מספק מידע מפורט לגבי האופן שבו שישה רכיבים עיקריים נקבעים בתהליך MCR. הדבר נעשה באמצעות ניתוח pca ואחריו השוואת צורה ספקטרלית בין עמסות עבור מודלים שנוצרו עם מספר שונה של רכיבים עיקריים. התהליך הניסיוני לאיסוף נתונים של חומרי ייחוס, כמו גם לנושאים אנושיים מוסבר בפרוטרוט.
Protocol
Representative Results
Discussion
במהלך איסוף הנתונים, כפי שמתואר בסעיף 2 ו-3 של הפרוטוקול, כל פרופיל עומק נאסף באזור עם מגע בין חלון המכשיר לבין העור על ידי מציאת האזורים הכהים יותר מהתמונות המיקרוסקופיים המסומנים בעיגולים האדומים ב איור 2ג. ברגע שאזורים אלה היו ממוקמים, זה היה קריטי להתחיל את פרופ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מכירים במידה רבה את התמיכה הכספית ממחלקת הטיפול האנליטי והאישי של הארגון. אנו רוצים להביע את הכרת התודה שלנו לבמאים המנהלים האנליטיים גב’ יסמין וואנג וד ר רוב גרדנר על הדרכתו והתמיכה שלהם ועל הגברת לי יאנג לעזרתה באיסוף מידע.
Materials
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol 3-sulfate sodium | Sigma-Aldrich | ||
| D-Erythro-Dihydrosphingosine | Sigma-Aldrich | ||
| DI water | Purified with Milipore(18.2MΩ) | ||
| Gen2-SCA skin analyzer | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | Gen2 | |
| Matlab 2018b | Mathwork | 2018b | |
| N-behenoyl-D-erythro-sphingosine | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| N-Lignoceroyl-D-erythro-sphinganine(ceramide) | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitoleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| PLS_Toolbox version 8.2 | Eigenvector Research Inc. | 8.2 | |
| RiverICon | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | version 3.2 | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | ||
| Stearic Acid | Sigma-Aldrich |
References
- Caspers, P., Lucassen, G., Bruining, H., Puppels, G. Automated depth – scanning confocal Raman microspectrometer for rapid in vivo determination of water concentration profiles in human skin. Journal of Raman Spectroscopy. 31 (8-9), 813-818 (2000).
- Crowther, J., et al. Measuring the effects of topical moisturizers on changes in stratum corneum thickness, water gradients and hydration in vivo. British Journal of Dermatology. 159 (3), 567-577 (2008).
- Egawa, M., Tagami, H. Comparison of the depth profiles of water and water-binding substances in the stratum corneum determined in vivo by Raman spectroscopy between the cheek and volar forearm skin: effects of age, seasonal changes and artificial forced hydration. British Journal of Dermatology. 158 (2), 251-260 (2008).
- Crowther, J. M., Matts, P. J., Kaczvinsky, J. R. . Changes in Stratum Corneum Thickness, Water Gradients and Hydration by Moisturizers. , (2012).
- Pudney, P. D., Mélot, M., Caspers, P. J., Van, D. P. A., Puppels, G. J. An in vivo confocal Raman study of the delivery of trans retinol to the skin. Applied Spectroscopy. 61 (8), 804 (2007).
- Mohammed, D., Matts, P., Hadgraft, J., Lane, M. In vitro-in vivo correlation in skin permeation. Pharmaceutical Research. 31 (2), 394-400 (2014).
- Hanlon, E., et al. Prospects for in vivo Raman spectroscopy. Physics in Medicine and Biology. 45 (2), 1 (2000).
- Mohammed, D., Crowther, J. M., Matts, P. J., Hadgraft, J., Lane, M. E. Influence of niacinamide containing formulations on the molecular and biophysical properties of the stratum corneum. International Journal of Pharmaceutics. 441 (1-2), 192-201 (2013).
- Boireau-Adamezyk, E., Baillet-Guffroy, A., Stamatas, G. Age-dependent changes in stratum corneum barrier function. Skin Research and Technology. 20 (4), 409-415 (2014).
- Pezzotti, G., et al. Raman spectroscopy of human skin: looking for a quantitative algorithm to reliably estimate human age. Journal of Biomedical Optics. 20 (6), 065008 (2015).
- Mlitz, V., et al. Impact of filaggrin mutations on Raman spectra and biophysical properties of the stratum corneum in mild to moderate atopic dermatitis. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 26 (8), 983-990 (2012).
- Janssens, M., et al. Lipid to protein ratio plays an important role in the skin barrier function in patients with atopic eczema. British Journal of Dermatology. 170 (6), 1248-1255 (2014).
- Faiman, R., Larsson, K. Assignment of the C H stretching vibrational frequencies in the Raman spectra of lipids. Journal of Raman Spectroscopy. 4 (4), 387-394 (1976).
- Edwards, H. G., Farwell, D. W., Williams, A. C., Barry, B. W., Rull, F. Novel spectroscopic deconvolution procedure for complex biological systems: vibrational components in the FT-Raman spectra of ice-man and contemporary skin. Journal of the Chemical Society, Faraday Transactions. 91 (21), 3883-3887 (1995).
- Choe, C., Lademann, J., Darvin, M. E. Lipid organization and stratum corneum thickness determined in vivo in human skin analyzing lipid-keratin peak (2820-3030 cm- 1) using confocal Raman microscopy. Journal of Raman Spectroscopy. 47 (11), 1327-1331 (2016).
- Stamatas, G. N., de Sterke, J., Hauser, M., von Stetten, O., van der Pol, A. Lipid uptake and skin occlusion following topical application of oils on adult and infant skin. Journal of Dermatological Science. 50 (2), 135-142 (2008).
- Choe, C., Lademann, J., Darvin, M. E. Confocal Raman microscopy for investigating the penetration of various oils into the human skin in vivo. Journal of Dermatological Science. , (2015).
- Zhang, L., et al. A MCR approach revealing protein, water and lipid depth profile in atopic dermatitis patients’ stratum corneum via in vivo confocal Raman spectroscopy. Analytical Chemistry. , (2019).
- Caspers, P. J. . In vivo Skin Characterization by Confocal Raman Microspectroscopy. , (2003).
- Jaumot, J., de Juan, A., Tauler, R. MCR-ALS GUI 2.0: New features and applications. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 140, 1-12 (2015).
- Choe, C., Choe, S., Schleusener, J., Lademann, J., Darvin, M. E. Modified normalization method in in vivo stratum corneum analysis using confocal Raman microscopy to compensate nonhomogeneous distribution of keratin. Journal of Raman Spectroscopy. , (2019).
- Wise, B. M., et al. Chemometrics tutorial for PLS_Toolbox and Solo. Eigenvector Research, Inc. 3905, 102-159 (2006).
