Мы описываем метод in vivo для исследования функциональной потери конкретного гена в спутниковых клетках с помощью комбинации кардиотоксина опосредованной травмы скелетной мышцы и инъекции самостоятельной доставки siRNA.
Скелетная мышца обладает огромной способностью к регенерации после травмы. Этот процесс в основном обусловлен мышечных стволовых клеток, также называют спутниковых клеток. Спутниковые клетки характеризуются выражением транскрипционного фактора Pax7 и их расположением под базальной ламиной в покоя скелетной мышце. После травмы, спутниковые клетки активируются, проходят самообновление или дифференциацию либо сформировать новые миофибы или слиться с поврежденными. Функциональность спутниковых клеток in vivo может быть исследована с помощью модели травмы скелетной мышцы на основе кардиотоксина. Для изучения функции одного гена во время регенерации скелетной мышцы в основном используются трансгенные модели мыши. Здесь мы представляем альтернативный метод трансгенных мышей, чтобы исследовать функцию гена в клетках спутника во время регенерации, например, в тех случаях, когда трансгенных мышей нет. Мы сочетаем кардиотоксин опосредоченные травмы конкретной скелетной мышцы с инъекцией самостоятельной доставки siRNA в регенерирующую мышцу, которая затем берется спутниковых клеток среди других клеток. Таким образом, мы предоставляем метод анализа функции генов в клетках спутника во время регенерации в физиологических условиях без необходимости трансгенных мышей.
Скелетная мышца является крупнейшей тканью организма, представляющей примерно 40% от общей массы тела, что позволяет добровольно еле-движение. Архитектура тканей скелетной мышцы в основном состоит из постмитотических, неизлечимо дифференцированных, многоядерных миофибы, а также различных других клеток периферической нервной системы, сосудистой системы и интерстициальных клеток1. Важно отметить, что скелетные мышцы обладает огромной способностью к регенерации и восстановлению функции при травме или повреждении2. Этот процесс зависит от ткани резидентов стволовых клеток мышц также называемый спутниковых клеток3,4. Спутниковые клетки расположены между миофибра и базальной ламиной и характеризуются выражением транскрипционного фактора Pax75,6,7. В гомеостатических условиях, спутниковые клетки тихие, но активироватьизируются из-за травматической травмы, например, через эксцентричные упражнения или экспериментально через инъекцию змеиного ядакардиотоксина 6,8. После активации, Pax7 положительные спутниковые клетки совместно выразить MyoD и Myf5, который совершает стволовые клетки к миогенной дифференциации. Спутниковые клетки, которые противостоят upregulation факторов приверженности сохранит свой потенциал ствола и вернуться к quiescence пополнить пул стволовых клеток для будущих потребностей. После расширения пула миогенных прародителей транскрипционные сети активируются такими факторами дифференциации, как Миогенин, чтобы инициировать выход клеточного цикла и терминальную дифференциацию. Эти миопрогенитора затем предохранитель друг к другу или существующих миофиферов способствует myonuclei для поддержания размера мионъюклея. Myofibers выразить терминальной дифференциации мышц генов, как Myosin Heavy Chain. Наконец, вновь образованные миофибы растут и созревают, чтобы построить функциональные единицы скелетной мышцы9,10.
Регенерация скелетных мышц может быть затронута различными заболеваниями, включая мышечные заболевания или старение11,12, начиная от легких нарушений для угрожающих жизни условий, например, в мышечной дистрофии Дюшенна13 , 14. Таким образом, регенеративная медицина направлена на восстановление поврежденных или неисправных скелетных мышечной ткани, используя присущие ей регенеративной энергии, ориентируясь на функцию спутниковых клеток15,16. Для полного использования полного потенциала требуется всестороннее понимание спутниковых клеток в их эндогенной нише при регенерации скелетной мышцы. Хотя существуют экспериментальные подходы к изоляции спутниковых ячеек, прилегающих к их миофиберам17,полная сложность клеточных и системных взаимодействий спутниковых клеток с их окружающей средой может быть повторена только в vivo. В этой связи, большие знания о регенерации скелетных мышц была приобретена с помощью мыши травмы модели2,18.
Здесь мы представляем специальную экспериментальную модель травмы мыши для изучения стволовых клеток опосредованной регенерации кардиотоксина индуцированного повреждения передней мышцы tibialis in vivo. Кардиотоксин, змея, производная цитолитический токсин, который вызывает деполяризацию миофрина и некроз, вводится в переднюю мышцу tibialis, что, в свою очередь, вызовет дегенерацию тканей с последующим регенерацией. Для анализа функции генов во время острой регенерации, самостоятельной доставки siRNAs вводят на 3-й день после травмы, на пике расширения спутниковых клеток. Экспериментальные животные приносятся в жертву в различные временные точки и tibialis передние мышцы собираются. Расчлененные мышцы замораживаются и обрабатываются для дальнейшего крио-секционирования. Иммунофлуоресцентная микроскопия затем используется для анализа маркеров регенерации. Этот метод позволяет исследует функцию одного гена во время спутниковой клеточной регенерации скелетных мышц с использованием мышей дикого типа.
Здесь мы представляем метод исследования функции конкретного гена во время регенерации скелетной мышцы без необходимости трансгенных животных. Это достигается путем сочетания кардиотоксининдуальной мышечной травмы с инъекцией самостоятельной доставки siRNA в регенерирующую скелетную мышцу на 3 день после травмы. Мы подробно описали процедуры мышечной травмы кардиотоксином, инъекцию самодоставки siRNA и обработку собранных мышц для анализа хода регенерации. Мы демонстрируем, что инъекция кардиотоксина змеиного яда в скелетную мышцу эффективно ранит всю мышцу и что самодоставка siRNAs находятся примерно в 75% всех спутниковых клеток среди других типов клеток через два дня после их инъекции в регенерации скелетной мышцы(рисунок 4, Рисунок 5).
Особое внимание следует уделить однородной травме передней мышцы tibialis, поскольку различные степени повреждения влияют на результат регенерации и тем самым также может быть затронуто воздействие siRNA. Кроме того, крайне важно, чтобы вся область регенерации была введена с самодоставкой siRNA. Для анализа процесса регенерации рекомендуется всегда сравнивать аналогичные области регенерирующей скелетной мышцы, поэтому передняя мышца tibialis должна быть разрезана пополам, чтобы всегда сравнивать область среднего живота мышцы. При анализе мышц, весь криосекция должна быть проанализирована, поскольку состав миофипла отличается в передней мышце tibialis и, следовательно, может регенерировать по-разному.
Функция спутниковых клеток может быть исследована с помощью различных экспериментальных процедур, включая их культуру на прилегающих изолированных одиночных миофиберах17, путем трансплантации и путем анализа регенерации скелетной мышцы после индуцированной травмы 18,19. Исследование функции спутниковых клеток с помощью модели индуцированной травмы in vivo, например, инъекции кардиотоксина, обеспечивает возможность анализа функции спутниковых клеток также с точки зрения их взаимодействия с другими типами клеток, такими как макрофаги и исследование влияния системных факторов2. Травма скелетной мышцы может быть достигнуто различными средствами, например, эксцентричные упражнения, замораживание травмы, инъекции BaCl2 или инъекции змеиных ядов, таких как кардиотоксин или notexin18. Хотя эксцентричный упражнения, вероятно, наиболее физиологических метод травмы, травмы одной конкретной мышцы только ограничено20. Замораживание травмы могут быть применены, когда миграция спутниковых клеток к месту травмы является целью исследования или только определенная часть мышцы должны быть повреждены. Экспериментально недостатком замораживания травм является открытая операция, которая должна быть выполнена для нанесения предварительно охлажденных металлических зондов. Инъекция BaCl2 или змеиные яды является наиболее драматическим методом травмы, тем самым бросая вызов функции спутниковых клеток больше всего. Кроме того, инъекция является минимально инвазивной, время операции, в целом, составляет менее пяти минут и не предполагает зашивания и т.д., тем самым минимизируя риск инфекций.
Мышечная травма в основном используется для исследования функциональных последствий потери генных функций, например, потери Pax77,21. Особенно, если пожилые мыши находятся в центре научного вопроса, генерации или использования трансгенных мышей часто не представляется возможным. Инъекция самодоставки siRNAs ориентации конкретного гена является жизнеспособной альтернативой в тех случаях, и был успешно использован22. Короче говоря, tibialis передней мышцы мышей был ранен путем инъекции кардиотоксина и самостоятельной доставки siRNAs, направленных против фибронектина (FN) были введены в день 3 после травмы. Мышцы были проанализированы через 10 дней после травмы и значительное снижение числа спутниковых клеток наблюдалось в siFN по сравнению с скремблированными условиями управления siRNA. Эффективность нокдауна была определена в целом мышцы lysates количественных реального времени ПЦР 2 дней после инъекции siRNA, снижение уровня экспрессии 58% было достигнуто, предполагая, что доставка и нокдаун эффективность достаточна для функциональных анализы22. Альтернативой для тестирования нокдаун эффективности являются либо иммуноблот или иммунофлуоресценции анализы с антителами, направленными против целевого гена. Эффективность и специфичность siRNA, используемой для инъекций in vivo, должна быть определена перед инъекцией на мышах, например, путем тестирования эффективности изолированных спутниковых клеток или первичных миобластов. Использование смарт-бассейна, состоящего из 4 различных siRNA по сравнению с одной siRNA увеличивает эффективность нокдауна, но и увеличивает риск неспецифического таргетинга. Специфика всех последовательностей siRNA, используемых должны быть проверены в культуре клеток, чтобы избежать вне цели эффектов. В качестве контроля следует использовать нецелевую скремнду, так как инъекция siRNA как таковой может повлиять на процесс регенерации из-за инъекции и, таким образом, дополнительное повреждение мышцы. Время введения siRNA зависит от научного вопроса и от экспрессии профиля гена-мишени. Как правило, инъекция самостоятельной доставки siRNA на 3 день после травмы кардиотоксина цели большинства генов, важных для пролиферации спутниковых клеток, так как спутниковая пролиферация клеток пики вокруг дня 3 после травмы. Время первой инъекции siRNA не должно быть меньше 48 ч после травмы кардиотоксина, так как объем инъекций кардиотоксина довольно высок и реабсорбции жидкости должны были иметь место до введения дополнительных растворов в мышцу. В целом, несколько инъекций siRNAs или сочетание различных siRNAs возможно, хотя следует учитывать, что каждая инъекция в регенерирующую мышцу вызывает дополнительный ущерб.
Одним из ограничений описанного метода является тот факт, что наблюдаемый эффект не обязательно зависит только от нокдауна гена-мишени в спутниковых клетках, но может быть отнесен к другим типам клеток, таким как иммунные клетки или фибро-адипогенные клетки-прародители. Поэтому необходимо совместить эти эксперименты с экспериментами, исследующими чистую популяцию спутниковых клеток. Можно либо выполнить эксперименты с использованием плавающих культур миофибра, где спутниковые клетки культивируются на прилегающих миофиперов или выполнять эксперименты трансплантации с использованием изолированных спутниковых клеток17.
Альтернативой инъекции самодоставки siRNAs является инъекция малых ингибиторов молекулы или рекомбинантных белков, которые могут быть выполнены, в зависимости от научного вопроса. Например, инъекция внеклеточного матричного белка фибронектин или малых молекулингингингизаторов jak/STAT сигнализации была успешно выполнена у пожилых мышей15,16. Анализ конкретной генной функции в одном конкретном типе клеток во время регенерации скелетных мышц, например, в спутниковых клетках, возможен только с помощью индуцируемой модели генетической мыши. Инъекции самодоставки siRNAs, рекомбинантных белков или малых ингибиторы молекулы могут повлиять на несколько типов клеток в регенерации скелетных мышц.
The authors have nothing to disclose.
Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих финансовых интересах.
isoflurane | Henry Schein | Isothesia | inhalation narcotics |
Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
Anesthesia System (Tec 7) with inhalation box + nose masks | Tem Sega | Minihub | |
shaver for rodents | isis | GT420 | |
cardiotoxin | Latoxan | L8102 | snake venom needed for muscle injury |
Accell siRNA smart pool | Dharmacon | depending on your target gene | self delivering siRNA |
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A-21206 | secondary antibody |
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher | A-21123 | secondary antibody |
Coverslips | VWR | 631-1574 | |
CV Mount | Leica | 14046430011 | mounting medium for immunohistochemistry |
DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | nuclear staining |
devMHC antibody | DHSB | F.1652 | |
Eosin Y | Thermo Fisher | 73104 | |
Haematoxylin Gill No3 | Sigma-Aldrich | GHS316-500ML | |
insulin syringe (29g) | Terumo | 3SS05M2813 | syringue used for muscle injections |
laminin antibody | Sigma Aldrich | L9393 | |
M.O.M blocking reagent | Vector labs | MKB-2213 | blocking for immunofluorescent staining |
Meloxicam | Boehringer Ingelheim | Metacam | analgesics |
OCT | Thermo Fisher | 6502 | tissue embedding |
Pax7 antibody | DSHB | PAX7 | satellite cell specific antibody |
ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher | P36934 | aequos mounting medium |
Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | tissue embedding |
Superfrost plus | Thermo Scientific | J1830AMNZ | microscope slides |
TritonX-100 | Amresco | 0694-1L | permeabilization reagent |
Dissection tools | |||
Dumont 5, straight | Fine Science Tools | 11295-10 | |
Dumont 7, curved | Fine Science Tools | 11272-40 | |
Extra fine Bonn scissors (cutting edge: 13 mm) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
Narrow pattern forceps | Fine Science Tools | 11002-16 | |
Spring scissors (cutting edge: 5 mm, tip diameter: 0.35 mm) | Fine Science Tools | 91500-09 |