Nós descrevemos um método in vivo para investigar a perda funcional de um gene específico em pilhas satélites usando uma combinação de ferimento mediado letal do músculo esqueletal e da injeção de um siRNA Self-entregando.
O músculo esquelético possui uma enorme capacidade de regeneração após lesão. Este processo é impulsionado principalmente por células-tronco musculares, também denominado células satélites. As células satélites são caracterizadas pela expressão do fator de transcrição Pax7 e sua localização embaixo da lâmina basal no músculo esquelético em repouso. Após a lesão, as células de satélite são ativadas, passam por autorenovação ou diferenciação para formar novas miofibras ou para fundir-se com os danificados. A funcionalidade das células de satélite in vivo pode ser investigada usando um modelo de lesão baseado em cardiotoxina do músculo esquelético. Para estudar a função de um gene durante a regeneração do músculo esquelético, modelos de camundongo transgênicos são usados principalmente. Aqui, nós apresentamos um método alternativo aos ratos transgênicas, para investigar a função do gene em pilhas satélites durante a regeneração, por exemplo, nos casos onde os ratos transgênicas não estão disponíveis. Nós combinamos o ferimento mediado letal de um músculo esqueletal específico com a injeção de um siRNA Self-entregando no músculo regenerando que é tomado então acima por pilhas satélites entre outras pilhas. Desse modo, nós fornecemos um método para analisar a função do gene em pilhas satélites durante a regeneração circunstâncias physiological sem a necessidade para ratos transgênicas.
O músculo esqueletal é o tecido o maior do corpo que representa aproximadamente 40% do peso de corpo total permitindo a locomoção voluntária. A arquitetura tecidual do músculo esquelético é composta principalmente por miofibras pós-mitóticas, terminalmente diferenciadas, multinucleadas, bem como várias outras células do sistema nervoso periférico, sistema vascular e células intersticiais1. Importante, o músculo esqueletal tem uma capacidade tremenda de regenerar e restaurar a função em cima da lesão ou do dano2. Esse processo depende das células-tronco musculares residentes no tecido também denominadas células satélites3,4. As células satélites estão localizadas entre o miofiber e a lâmina basal e caracterizadas pela expressão do fator de transcrição Pax7,5,6,7. Em condições homeostáticas, as células satélites são quiescentes, mas são ativadas devido a lesões traumáticas, por exemplo, através de exercícios excêntricos ou experimentalmente através da injeção do veneno de cobra cardiotoxina6,8. Uma vez ativadas, Pax7 células satélites positivas expressam MyoD e Myf5, que compromete as células-tronco à diferenciação miogênica. As células satélites que resistem ao upregulation de fatores do compromisso conservarão seu potencial do células e retornarão ao quiescência para reabastecer a associação da pilha de haste para demandas futuras. Após a expansão da Associação de progenitoras miogênicas, as redes transcricional são ativadas por fatores de diferenciação como Myogenin para iniciar a saída do ciclo celular e a diferenciação terminal. Estes myoprogenitors fundem-se então a se ou às miofibras existentes que contribuem internos para manter o tamanho do domínio myonuclear. Os myofibers expressam genes terminais da diferenciação do músculo como a corrente pesada de myosin. Finalmente, as miofibras recém-formadas crescem e amadurecem para construir as unidades funcionais do músculo esquelético9,10.
A regeneração do músculo esquelético pode ser afetada por váriascondições, incluindodoenças musculares ou envelhecimento11,12, variandode deficiências leves a condições de risco de vida, por exemplo, em distrofia muscular de Duchenne13 , 14. portanto, a medicina regenerativa tem como objetivo restaurar o tecido muscular esquelético danificado ou defeituoso usando seu poder regenerativo inerente, visando afunção de céluladesatélite15,16. Para usar seu pleno potencial uma compreensão detalhada de pilhas satélites em seu Niche endógeno durante a regeneração do músculo esqueletal é exigida. Embora existam abordagens experimentais para isolar as células satélites adjacentes às suas miofibras17, a complexidade total das interações celulares e sistêmicas das células satélites com seu ambiente só pode ser recapitulada in vivo. Nesse sentido, grandes conhecimentos sobre a regeneração muscular esquelética foram adquiridos por meiode modelosdelesão do camundongo,18.
Aqui nós introduzimos um modelo experimental específico do ferimento do rato para estudar a regeneração negociada da pilha de haste de dano cardiotoxin-induzido do músculo anterior dos tibial in vivo. A cardiotoxina, uma toxina citolítica derivada da serpente que causa a despolarização e a necrose do interiorizados, é injetada no músculo anterior dos tibial, que por sua vez provocará a degeneração do tecido seguida pela regeneração. Para analisar a função dos genes durante a regeneração aguda, os siRNAs Self-entregando são injetados no dia 3 após ferimento, no pico da expansão da pilha Satellite. Os animais experimentais são sacrificados em vários pontos temporais e os músculos tibial anterior são coletados. Os músculos dissecados são congelados e processados para posterior crioseccionamento. A microscopia da imunofluorescência é usada então para analisar marcadores da regeneração. Este método permite a investigação da função de um único gene durante a regeneração conduzida da pilha satélite do músculo esqueletal usando ratos do tipo selvagem.
Aqui nós apresentamos um método para investigar a função de um gene específico durante a regeneração do músculo esqueletal sem a necessidade de animais transgênicas. Isto é conseguido pela combinação de cardiotoxina induzida ferimento de músculo com a injeção de um siRNA Self-entregando no músculo esqueletal de regeneração no dia 3 após ferimento. Nós descrevemos em detalhe os procedimentos da lesão de músculo por cardiotoxin, a injeção do self-entregando o siRNA e o processamento dos músculos colhidos para analisar o progresso da regeneração. Nós demonstramos que a injeção da cardiotoxina do veneno da serpente no músculo esqueletal fere eficazmente o músculo inteiro e que os siRNAs Self-entregando são encontrados em aproximadamente 75% de todas as pilhas satélites entre outros tipos da pilha dois dias após sua injeção no regeneração do músculo esquelético (Figura 4, Figura 5).
A atenção particular deve ser focalizada em um ferimento homogêneo do músculo anterior dos tibial desde que os graus de variação de ferimento influenciam o resultado da regeneração e desse modo também o efeito do siRNA pôde ser afetado. Além disso, é extremamente importante que toda a área regeneradora seja injetada com o siRNA Self-entregando. Para a análise do processo de regeneração, recomenda-se sempre comparar áreas semelhantes do músculo esquelético regenerador, portanto, o músculo tibial anterior deve ser cortado ao meio para sempre comparar a região do meio-ventre do músculo. Ao analisar o músculo, o criossecção inteiro precisa de ser analisado desde que a composição do interiorizados difere no músculo anterior dos tibial e pôde conseqüentemente regenerar diferentemente.
A função das células satélites pode ser investigada por vários procedimentos experimentais, incluindo sua cultura nas miofibras isoladas adjacentes17, por transplante e analisando a regeneração do músculo esquelético após lesão induzida 18,19. Investigar a função de células de satélite usando um modelo de lesão induzida in vivo, por exemplo, injeção de cardiotoxina, fornece a capacidade de analisar a função de células de satélite também em termos de sua interação com outros tipos de células, como macrófagos e investigação da influência de fatores sistêmicos2. O ferimento do músculo esqueletal pode ser conseguido por vários meios, por exemplo, exercício excêntrico, ferimento do gelo, injeção de BaCl2 ou injeção de venenos da serpente tais como o letal ou o notexin18. Quando o exercício excêntrico for provavelmente o método o mais fisiológico da lesão, a lesão a um músculo particular é limitada somente20. Os ferimentos do gelo podem ser aplicados quando a migração de pilhas satélites para o local da lesão for o alvo do estudo ou somente uma parte específica do músculo deve ser ferida. Experimentalmente, a desvantagem das lesões por congelamento é a cirurgia aberta que precisa ser realizada para aplicar a sonda metálica pré-resfriada. A injeção de BaCl2 ou de venenos da serpente é o método o mais dramático de ferimento, desafiando desse modo a função da pilha satélite mais. Além disso, a injeção é minimamente invasiva, o tempo de cirurgia, em geral, é inferior a cinco minutos e não envolve a sutura, etc, minimizando assim o risco de infecções.
A lesão muscular é usada principalmente para investigar as conseqüências funcionais da perda de funções genéticas, por exemplo, perda de Pax7,7,21. Especialmente se os camundongos envelhecidos são o foco da questão científica, a geração ou uso de camundongos transgênicos muitas vezes não é viável. A injeção de siRNAs Self-entregando que alvejam um gene específico é uma alternativa viável naqueles casos e foi usada com sucesso22. Em suma, o músculo tibial anterior dos camundongos foi ferido por injeção de cardiotoxina e os siRNAs de autoentrega dirigidos contra fibronectina (FN) foram injetados no dia 3 após a lesão. Os músculos foram analisados 10 dias após a lesão e uma diminuição significativa nos números de células satélites foi observada em siFN versus condições de controle de siRNA mexidos. A eficiência do knockdown foi determinada em lysates inteiros do músculo pelo PCR quantitativo do tempo real 2 dias após a injeção de siRNA, uma redução em níveis da expressão de 58% foi conseguida sugerindo que a eficiência da entrega e do knockdown seja suficiente para funcional análises de22. As alternativas para testar a eficiência do knockdown são análises do immunoblot ou da imunofluorescência com os anticorpos dirigidos de encontro ao gene do alvo. A eficiência e a especificidade do siRNA usados para injeções in vivo devem ser determinadas antes da injeção em camundongos, por exemplo, testando a eficiência em células satélites isoladas ou mioblasts primários. O uso de um pool inteligente que consiste em 4 siRNAs diferentes versus um único siRNA aumenta a eficiência do knockdown, mas também aumenta o risco de segmentação inespecífica. A especificidade de todas as sequências de siRNA utilizadas deve ser testada na cultura celular para evitar efeitos fora do alvo. Como um controle, um siRNA não-alvo mexidos deve ser usado desde a injeção de um siRNA per se pode influenciar o processo de regeneração devido à injeção e, assim, danos adicionais do músculo. O ponto do tempo de injetar o siRNA é dependendo da pergunta científica e no perfil da expressão do gene do alvo. Geralmente, uma injeção de siRNA Self-entregando no dia 3 após ferimento do letal alvos a maioria de genes importantes para a proliferação da pilha satélite desde picos da proliferação da pilha satélite em torno do dia 3 após ferimento. O ponto de tempo para a primeira injeção de siRNA não deve ser inferior a 48 h após a lesão de cardiotoxina, uma vez que o volume de injeção de cardiotoxina é bastante elevado e a reabsorção do líquido deve ter ocorrido antes de injetar soluções adicionais no músculo. Em geral, múltiplas injeções de siRNAs ou uma combinação de diferentes siRNAs é possível, embora se deva considerar que cada injeção no músculo regenerador está causando danos adicionais.
Uma limitação do método descrito é o fato, que o efeito observado não é necessariamente somente dependendo do knockdown do gene do alvo em pilhas satélites mas pôde ser atribuído a outros tipos da pilha tais como pilhas imunes ou células fibro-adipogenic do progenitor. Portanto, é necessário combinar esses experimentos com experimentos investigando uma população pura de células satélites. Pode-se realizar experimentos usando culturas de miofibras flutuantes, onde as células satélites são cultivadas em suas miofibras adjacentes ou realizar experimentos de transplante usando células satélites isoladas17.
Uma alternativa à injeção de siRNAs Self-entregando é a injeção de nervos inibidores pequenos da molécula ou de proteínas de recombinação que podem ser executadas, dependendo da pergunta científica. Por exemplo, a injeção da proteína da matriz extracelular fibronectina ou inibidores da molécula pequena da sinalização de Jak/stat foram executadas com sucesso em camundongos envelhecidos15,16. A análise de uma função específica do gene em um tipo específico da pilha durante a regeneração do músculo esqueletal, por exemplo, em pilhas satélites, é somente possível com o uso de um modelo genético induzível do rato. As injeções de siRNAs Self-entregando, de proteínas de recombinação ou de nervos inibidores pequenos da molécula puderam afetar tipos múltiplos da pilha no músculo esqueletal de regeneração.
The authors have nothing to disclose.
Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.
isoflurane | Henry Schein | Isothesia | inhalation narcotics |
Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
Anesthesia System (Tec 7) with inhalation box + nose masks | Tem Sega | Minihub | |
shaver for rodents | isis | GT420 | |
cardiotoxin | Latoxan | L8102 | snake venom needed for muscle injury |
Accell siRNA smart pool | Dharmacon | depending on your target gene | self delivering siRNA |
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A-21206 | secondary antibody |
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher | A-21123 | secondary antibody |
Coverslips | VWR | 631-1574 | |
CV Mount | Leica | 14046430011 | mounting medium for immunohistochemistry |
DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | nuclear staining |
devMHC antibody | DHSB | F.1652 | |
Eosin Y | Thermo Fisher | 73104 | |
Haematoxylin Gill No3 | Sigma-Aldrich | GHS316-500ML | |
insulin syringe (29g) | Terumo | 3SS05M2813 | syringue used for muscle injections |
laminin antibody | Sigma Aldrich | L9393 | |
M.O.M blocking reagent | Vector labs | MKB-2213 | blocking for immunofluorescent staining |
Meloxicam | Boehringer Ingelheim | Metacam | analgesics |
OCT | Thermo Fisher | 6502 | tissue embedding |
Pax7 antibody | DSHB | PAX7 | satellite cell specific antibody |
ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher | P36934 | aequos mounting medium |
Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | tissue embedding |
Superfrost plus | Thermo Scientific | J1830AMNZ | microscope slides |
TritonX-100 | Amresco | 0694-1L | permeabilization reagent |
Dissection tools | |||
Dumont 5, straight | Fine Science Tools | 11295-10 | |
Dumont 7, curved | Fine Science Tools | 11272-40 | |
Extra fine Bonn scissors (cutting edge: 13 mm) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
Narrow pattern forceps | Fine Science Tools | 11002-16 | |
Spring scissors (cutting edge: 5 mm, tip diameter: 0.35 mm) | Fine Science Tools | 91500-09 |