Summary
Vi beskriver en in vivo metod för att undersöka funktionell förlust av en specifik gen i satellit celler genom att använda en kombination av kardiotoxin medierad skada av skelettmuskulaturen och injektion av en självförsörjande siRNA.
Abstract
Skelettmuskulaturen besitter en enorm förmåga att regenerera efter skada. Denna process drivs främst av muskelstamceller, även kallade satellit celler. Satellit celler kännetecknas av uttrycket av transkriptionsfaktorn Pax7 och deras placering under den basala lamina i vila skelettmuskulaturen. Vid skada, satellit celler få aktiveras, genomgå självförnyelse eller differentiering till antingen bilda nya myofibers eller att smälta med skadade sådana. Funktionaliteten hos satellit celler in vivo kan undersökas med hjälp av en kardiotoxin baserad skada modell av skelettmuskulaturen. För att studera funktionen av en gen under regenerering av skelettmuskulaturen, transgena möss modeller används oftast. Här presenterar vi en alternativ metod för att transgena möss, att undersöka gen funktionen i satellit celler under förnyelse, t. ex., i fall där transgena möss inte är tillgängliga. Vi kombinerar kardiotoxin medierad skada av en specifik skelettmuskulaturen med injektion av en själv-leverera siRNA i regenererande muskler som sedan tas upp av satellit celler bland andra celler. Därmed, vi ger en metod för att analysera genfunktion i satellit celler under föryngring under fysiologiska förhållanden utan behov av transgena möss.
Introduction
Skelettmuskulaturen är kroppens största vävnad som representerar cirka 40% av den totala kroppsvikten möjliggör frivillig förflyttning. Vävnads arkitekturen i skelettmuskulaturen består huvudsakligen av postmitotiska, terminalt differentierade, multinukleerade myofibers samt olika andra celler från det perifera nervsystemet, vaskulära systemet, och interstitiella celler1. Viktigt, skelettmuskulaturen har en enorm förmåga att regenerera och återställa funktionen vid skada eller skada2. Denna process beror på vävnad bosatta muskelstamceller också kallas satellit celler3,4. Satellit celler är placerade mellan myofiber och basal lamina och kännetecknas av uttrycket av transkriptionsfaktorn Pax75,6,7. Under homeostatiska förhållanden, satellit celler är quiescent men få aktiveras på grund av traumatisk skada, e.g., genom excentrisk övning eller experimentellt genom injektion av ormen Venom cardiotoxin6,8. När aktiverad, Pax7 positiva satellit celler Co-Express MyoD och Myf5, som begår stamceller till Myogenic differentiering. Satellit celler som motsätter sig uppreglering av engagemang faktorer kommer att behålla sin stemness potential och återgå till vilo att fylla på stamcells bassängen för framtida krav. Efter utbyggnaden av Myogenic stamcells bassängen, transkriptionella nätverk aktiveras genom differentiering faktorer som Myogenin att initiera cellcykeln exit och Terminal differentiering. Dessa myoprogenitors sedan säkring till varandra eller till befintliga myofibers bidragande myonuklei att bibehålla storleken på myonukleära domänen. Den myofibers Express Terminal muskel differentiering gener som myosin tung kedja. Slutligen, den nybildade myofibers växa och mogna för att bygga de funktionella enheter av skelettmuskulaturen9,10.
Regenerering av skelettmuskulaturen kan påverkas av olika förhållanden, inklusive muskelsjukdomar eller åldrande11,12, allt från milda nedskrivningar till livshotande tillstånd, e.g., i Duchennes muskeldystrofi13 , 14. regenerativ medicin syftar därför till att återställa skadad eller funktionsstörning skelettmuskelvävnad med hjälp av dess inneboende regenerativ effekt genom att rikta satellit cells funktion15,16. Att använda sin fulla potential en omfattande förståelse av satellit celler i deras endogena nisch under regenerering av skelettmuskulaturen krävs. Även experimentella metoder finns för att isolera satellit celler i anslutning till deras myofibers17, den fulla komplexiteten av cellulära och systemiska interaktioner av satellit celler med sin omgivning kan endast återfått in vivo. I detta avseende har stor kunskap om skelettmuskel förnyelse förvärvats med hjälp av mus skada modeller2,18.
Här introducerar vi en specifik experimentell mus skademodell för att studera stamcells-medierad förnyelse av kardiotoxin-inducerad skada av tibialis främre muskel in vivo. Cardiotoxin, en orm som härrör cytolytiskt toxin som orsakar myofiber depolarisering och nekros, injiceras i tibialis främre muskeln, som i sin tur kommer att utlösa vävnads degeneration följt av förnyelse. För att analysera geners funktion vid akut förnyelse injiceras självförsörjande siRNAs vid dag 3 efter skada, vid toppen av satelliten cell expansion. Försöksdjur offras vid olika tidpunkter och tibialis främre muskler samlas in. De dissekerade musklerna fryses och bearbetas för ytterligare kryo-snittning. Immunofluorescensmikroskopi används sedan för att analysera regenereringsmarkörer. Denna metod möjliggör utredning av funktionen av en enda gen under satellit cell driven förnyelse av skelettmuskulaturen med hjälp av vild typ möss.
Protocol
Alla djurförsök godkändes av den djurskydds avdelning i Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz (03-048/16; TLV Bad Langensalza, Tyskland).
1. kardiotoxin-inducerad muskel skada
Anmärkning: Utföra alla experiment med levande möss i enlighet med den nationella djurskydds lagen och under lämpliga aseptiska förhållanden. Avkall på djur måste också utföras i enlighet med den nationella djurskydds lagen.
- Desinficera inhalations boxen som används för inhalationsanestesi och kirurgiska området med 70% etanol. Placera en steril kirurgisk trasa på värmeplattan där operationen kommer att äga rum.
- Slå på värmedynan vid 37 ° c.
- Administrera analgetika (t. ex. 1 mg/kg kroppsvikt meloxikam subkutant) 15 min innan operationen påbörjas.
Anmärkning: För ett typiskt experiment, Använd möss som är minst 6 veckor gamla, kön matchade och i en god allmän fysisk kondition. - Bered kardiotoxin lösningen (20 μM i 0,9% NaCl), förvara lösningen vid-20 ° c.
- Låt cardiotoxin-lösningen nå rumstemperatur (RT).
- Överför musen till inandnings boxen och inducera anestesi med isofluran (initiering 3,5 – 5% i rent syre). Kontrollera djupet av anestesi med en brist på svar på en tå nypa.
- Placera musen på en ren pappershandduk och underhålla anestesi med en näs mask (1,5 – 3% isofluran i rent syre). Raka injektionsområdet av kraniala nedre benet (från knä till tass, figur 1a). Ta bort allt överdrivet löst hår.
Anmärkning: Fysiskt separera rakning och injektionsområdet i rummet kommer att ge mer sterila villkor för injektionerna. - Placera musen i sidled recumbent position på värme pad täckt med en steril kirurgisk trasa och underhålla anestesi med en näsa mask (1,5 – 3% isofluran i rent syre).
- Desinficera injektionsområdet av kranialunderben (från knä till tass) med 70% etanol.
- Utför en tå nypa innan du påbörjar intramuskulär injektion för att säkerställa ett adekvat djup av anestesi.
- Injicera 50 μL kardiotoxin (20 μM i 0,9% NaCl) i tibialis främre muskel med hjälp av en insulinspruta med en 29-gauge nål. Först, Pierce huden bara distala av knäet.
- Stick in nålen helt i muskeln (i myofiber orientering/parallellt med skenbenet ben) och injicera cardiotoxin långsamt (10-20 s) längs den fulla längden av muskeln medan du flyttar nålen fram och tillbaka för att möjliggöra en jämn fördelning av cardiotoxin därmed skada hela tibialis främre muskel (figur 1B, C).
Anmärkning: Skada tibialis främre muskeln från endast ett ben, den kontralaterala tibialis främre muskeln kan fungera som en intern kontroll för att fastställa att skelettmuskulaturen inte var patologiskt drabbade före kardiotoxin skada. - Överför musen tillbaka till sin bur placeras på en värmedyna och övervaka återhämtningsprocessen tills djuret är medvetet och blir ambulatorisk.
Anmärkning: Mössen kommer bara att visa en liten halta. Om möss är haltande tungt och inte lägga vikt på benet alls, offra musen. - Administrera analgetika under de följande 2 dagarna (t. ex. 1 mg/kg kroppsvikt meloxikam subkutant, varje 24 h) och övervaka dem på veckobasis.
2. injektion av självförsörjande siRNA i den regenererande tibialis främre muskeln (dag 3 post Kardiotoxin skada)
- Bered siRNA-lösningen genom att omlägga siRNA (t. ex. siRNA Smart pool) i 0,9% NaCl (slutkoncentration på 2 μg/μL) enligt tillverkarens anvisningar.
Anmärkning: SiRNA modifieras kemiskt för att underlätta det passiva upptaget av celler och skydda den från nukleasnedbrytning. Inga transfektionsreagens behövs, vilket minskar toxiciteten. Att använda en smart pool med fyra oberoende siRNA-sekvenser som riktar sig mot samma gen ökar knockdown-effektiviteten. - Förvara siRNA vid-20 ° c och överför den på is till operationssalen.
- Desinficera inhalations boxen som används för inhalationsanestesi och kirurgiska området med 70% etanol. Placera en steril kirurgisk trasa på värmeplattan där operationen kommer att äga rum.
- Slå på värmedynan vid 37 ° c.
- Överför musen till inandnings boxen och inducera anestesi med isofluran (initiering 3,5 – 5% i rent syre). Kontrollera djupet av anestesi med en brist på svar på en tå nypa.
- Placera musen i sidled recumbent position på värme pad täckt med en steril kirurgisk trasa och underhålla anestesi med en näsa mask (1,5 – 3% isofluran i rent syre).
- Desinficera injektionsområdet av kranialunderben (från knä till tass).
- Utför en tå nypa innan du påbörjar intramuskulär injektion för att säkerställa ett adekvat djup av anestesi.
- Injicera upp till 50 μL siRNA-lösning (upp till 100 μg totalt i 0,9% NaCl; riktad mot målgenen; Använd kodade siRNA som kontroll) i den skadade tibialis främre muskeln med en insulinspruta med en 29 G nål. Först, Pierce huden bara distala av knäet, sedan in nålen i tibialis främre muskeln.
- Sätt in nålen helt i muskeln (i myofiber orientering/parallellt med skenbenet ben) och injicera siRNA lösningen långsamt (10-20 s) längs hela muskel längden medan du flyttar nålen fram och tillbaka för att möjliggöra en jämn fördelning av siRNA längs hela tibialis främre muskeln.
- Överför musen tillbaka till sin bur placeras på en värmedyna och övervaka återhämtningsprocessen tills djuret är medvetet och blir ambulatorisk.
Anmärkning: Analgesi är inte nödvändigtvis efter injektionen av siRNA.
3. dissektion av tibialis främre muskel
- Förbered frys lösningen (2 delar ULT förening och 1 del 30% sackaros i avjoniserat vatten) minst 12 h före användning för att undvika luftbubblor.
- Förbered frysning formar genom att Linda en aluminiumfolie runt en penna och täta den med tejp. Det är viktigt att botten av mögel ger en jämn, sluten yta.
Anmärkning: Mindre frysning formar möjliggöra snabbare frysning av muskeln undvika frysning artefakter. - Offra musen, till exempel genom CO2 inandning, vid respektive tidpunkt för förnyelse och spraya hela musen och dissektion verktyg med 70% etanol.
Anmärkning: Cervikal dislokation kan tillämpas, dessutom, för att undvika överdriven blödning vid benet när isolera tibialis främre muskeln. - Ta bort pälsen och huden från den skadade bakbenen genom att skära huden vid vristen med extra fin vass sax (skäregg: 13 mm) och dra upp huden mot knäet med pinpett.
- För att exponera tibialis främre senan vid fotleden, dra den återstående huden mot foten eller skära med vassa saxar.
Anmärkning: Musen kan fästas på en stöd bräda för att möjliggöra bättre fixering. - Innan skörd av tibialis främre muskeln, ta bort fascia med hjälp av finpinstång (Dumont 5 eller 7, raka eller böjda). Nyp den stängda tången genom fascian bredvid Tibia benet vid vristen av den skadade benet (figur 2A). Flytta tång mot knä och därmed Riva fascian och utsätta tibialis främre muskeln (figur 2b).
- För att isolera tibialis främre muskeln, exponera distala senan och ta tag i den med fina pincuper (Dumont 7, böjda). Skär senan med vår sax (skäregg: 5 mm, spets diameter: 0,35 mm) och dra i muskeln (hålla den vid senan) mot knäet.
- Att skörda tibialis främre muskeln, klippa det så nära knäet som möjligt med hjälp av vassa saxar.
- Innan frysning, klippa tibialis främre muskeln vid mitten av magen regionen av muskeln med raka sax i två halvor av samma storlek för att möjliggöra analys av mitten magen regionen (figur 2C, D).
- Fyll frysning mögel halvvägs med frys lösningen.
- Sätt de två halvorna av tibialis främre muskeln i frysning mögel med mitten magen regionen vänd mot botten av mögel (figur 2e). Se till att tibialis främre halvorna sätts i ett upprätt läge lutad mot väggen i frysning mögel för att undvika deponering av muskeln.
Anmärkning: Ju mer frysning lösningen är i mögel, ju längre frysningen kommer att ta, vilket ökar risken för Cryo-artefakter. - Håll frys formen med hjälp av tång och överför den halvvägs till flytande kväve (figur 2F). Se till att ingen flytande kväve går in i frysning mögel under frysprocessen.
- Observera frysprocessen, fryser mediet ändrar färg från transparent till vitt och blir solid. Submerse frysning mögel i flytande kväve under några sekunder och överföra frysning mögel till a-80 ° c frys eller till torris för framtida bearbetning.
- Förvara frysta muskler i frysning formar vid-80 ° c tills ytterligare användning.
Anmärkning: Den frysning formar passar bra i 24-väl plattor eller 1,5 mL reaktionsrör möjliggör märkning och organiserad förvaring. - Hantera muskeln i frysning formar för vidare användning alltid på torris.
4. kryosektionering av regenererande tibialis främre muskel
- Innan snittningen påbörjas, Ställ in kammartemperaturen på kryostaten till-21 ° c, objekt temperaturen till-20 ° c och skär tjockleken till 10, 12 eller 14 μm (beroende på framtida tillämpningar) (figur 3a).
- Överför muskel provet i frys formen till kryostaten och låt den anpassa sig till temperaturen i flera minuter. Under denna tid, märk mikroskopet diabilder.
- Ta bort folien runt den inbäddade muskeln med hjälp av förkylnings tång inuti kryostaten. Undvik att röra vid provet eftersom cryomedium börjar Tina lätt.
- Montera provet med mitten magen regionen av tibialis främre muskeln riktas uppåt på metall provet innehavaren av kryostat med cryomedium. Detta säkerställer att skär platsen av muskeln (botten av mögel) är vänd mot försöksledaren.
- Sätt in provhållaren med det monterade provet i snittningsmekanismen.
Anmärkning: För att säkerställa korrekt snittning av provet, Använd ett nytt blad innan du börjar. - Trimma först prov blocket (30 μm) för att få ett jämnt snittnings plan och nå respektive region i muskeln (figur 3b).
- Efter trimning, skära på varandra följande avsnitt av respektive tjocklek (t. ex. 14 μm).
- Samla sektionerna på Mikroskop glas diabilder genom att hålla bilden vänd nedåt över avsnittet. Sektionen är fäst vid bilden (bild 3c).
- Förvara sektioner vid-80 ° c eller-20 ° c tills vidare användning eller direkt användning för immunofluorescens eller immunohistokemi.
5. immunofärgning för markörer för regenerering
- Utför alla ytterligare steg i en fuktad kammare.
- Kort, jämvikt sektionerna i rumstemperatur.
- Fix sektioner med 1 mL 2% PFA (i PBS, pH 7,4) per Slide för 5 min vid RT.
- Ta bort 2% PFA-lösningen genom att hälla den i respektive avfallsbehållare.
- Tvätta 3 gånger med 1 mL PBS (pH 7,4) i 5 minuter vid RT.
- Ta bort PBS genom att hälla den i en avfallsbehållare.
- Per Slide, tillsätt 1 ml av depolarisering lösning (0,1% Triton X-100, 0,1 M glycin i PBS pH 7,4) för 10 min.
- Ta bort permeabiliseringslösningen genom att hälla den i en avfallsbehållare.
- Tillsätt 150 μL av den blockerande lösningen (M.O.M. 1:40 i PBS pH 7,4) per Slide och täck med täckglaset. Inkubera i 1 h vid RT.
- Ta bort täckglaset och den blockerande lösningen, applicera 100 μL primär antikropps lösning [PAX7, DSHB, Mouse IgG1, outspädd eller devMHC, DSHB, outspädd, mus IgG1and laminin (kanin, 1:1000)] per bild. Täck med täckslip. Inkubera O/N (över natten) vid 4 ° c.
Anmärkning: Utför en kontroll färgning genom att utelämna de primära antikropparna, inkubera avsnittet med blockerande lösning istället. - Tvätta 3 gånger med 1 mL PBS (pH 7,4) i 5 minuter vid RT.
- Ta bort PBS genom att hälla den i en avfallsbehållare.
- Tillsätt 100 μL av den sekundära antikroppslösningen (Alexa fluor 546 Goat anti-Mouse IgG1 och Alexa fluor 488 Donkey anti-Rabbit IgG i blockeringslösning, 1:1 000) per Slide och täck med täckglaset. Inkubera i 1 h vid RT.
- Inkubera bilderna i mörker, t. ex., Använd en aluminiumfolie för att täcka eller använda en svart fuktad kammare.
Anmärkning: Från och med nu bör alla steg utföras i mindre ljusförhållanden eftersom vissa sekundära antikroppar är ljuskänsliga. - Ta bort täckslip och den sekundära antikroppslösningen.
- Tvätta 3 gånger med 1 mL PBS (pH 7,4) i 5 minuter vid RT.
- Ta bort PBS genom att hälla den i en avfallsbehållare.
- Utför DAPI-färgning genom att tillsätta 1 mL av lösningen per bild till en slutlig koncentration på 10 μg/mL i 5 minuter vid RT.
- Ta bort DAPI-färgningslösningen genom att hälla den i en avfallsbehållare.
- Tvätta 3 gånger med 1 mL PBS (pH 7,4) i 5 min vid RT.
- Ta helt bort PBS som används för tvättning.
- Applicera 2 – 3 droppar vattenhaltiga monteringsmedel och täck direkt bilden med en ny täckslip.
- Låt bilderna torka i 1 h vid RT i mörkret.
- Förvara de färgade sektionerna vid 4 ° c i mörker tills ytterligare analys med hjälp av ett fluorescensmikroskop.
6. hematoxylin och eosin färgning
- Utför alla ytterligare steg i en fuktad kammare.
- Fix sektioner med 1 mL 2% PFA (i PBS, pH 7,4) per Slide för 5 min vid RT.
- Ta bort 2% PFA-lösningen genom att hälla den i respektive avfallsbehållare.
- Överför bilderna till en Coplin burk.
- Skölj glasen försiktigt med kranvatten.
Anmärkning: Slå inte på kranen för hög eftersom det kan skada avsnitten. - Överför bilderna till den fuktade kammaren. Ta bort vätskan.
- Applicera 1 mL hematoxylin-färgningslösning (Gill nr 3) i 2 minuter.
- Överför bilderna till en Coplin burk.
- Skölj glasen försiktigt med kranvattnet tills kärmen blir blått.
Anmärkning: Slå inte på kranen för hög eftersom det kan skada dina sektioner. - Överför bilderna till den fuktade kammaren. Ta bort vätskan.
- Applicera 1 mL eosin Y-lösning och inkubera i 2 minuter.
- Överför bilderna till en Coplin burk.
- Skölj glasen försiktigt med kranvatten tills kranvattnet lossnar från bilderna.
- Ta bort all vätska och låt glidbanorna torka i 2 min.
- Montera i monteringsmedel som lämpar sig för immunohistokemi.
Representative Results
Ett typiskt resultat av en hematoxylin och eosin (H & E) färgning av en tibialis främre muskel före och efter kardiotoxin medierad skada presenteras i figur 4a, B. I kontroll musklerna, är arkitekturen av muskeln intakt sett genom lokalisering av kärr i periferin av myofibers och avsaknaden av ackumulering av mononukleerade celler i interstitiell rymden (figur 4a). 7 dagar efter kardiotoxin medierad skada nya myofibers bildas kännetecknas av centralt belägna kärnor (figur 4b). Dessutom kan en ackumulering av mononukleerade celler observeras, bestående mestadels av satellit celler men även icke-myogena celler som immunceller. Hela muskeln bör skadas kännetecknas av den centrala placeringen av alla myonuklei och ackumulering av mononukleerade celler på hela muskel sektionen.
För att karakterisera utvecklingen och framgången för regenereringsprocessen kan flera Immunofluorescerande fläckar med hjälp av markörer för regenerering utföras. Antalet satellit celler kan utvärderas genom färgning för Pax7, den kanoniska markören för satellit celler (figur 4C, D). Tre dagar efter skada ökar antalet satellit celler (figur 4D), satellit celler är inte placerade under den basala lamina längre. För att ytterligare analysera regenereringsprocessen, nybildade myofibers kan färgas med antikroppar riktade till utvecklingsmyosin (figur 4E). Nybildade myofibers Visa centralt belägna kärnor och ett starkt uttryck för utvecklingsstörning myosin. Som myofibers mogna, uttryck för utvecklingsmässiga myosin minskar, diametern på myofiber ökar medan kärnor migrerar till periferin av myofibers.
Påverkan av en enda gen på regenereringsprocessen kan undersökas med hjälp av transgena möss eller som visas här genom injektion av en självförsörjande siRNA. Fluorescently märkt Self-leverera kodade kontroll siRNA injicerades i regenererande tibialis främre muskeln på dag 3 efter skada, den tidpunkt då spridningen av satellit celler toppar. Två dagar efter injektion av siRNA satellit celler analyserades för närvaron av den fluorescerande märkta siRNA (figur 4F). Vi analyserade hur många satellit celler som hade tagit upp den fluorescerande etiketten siRNA två dagar efter injektion i regenererande muskeln (figur 5). Omkring 75% av alla satellit celler i regenererande muskeln var positiva för den fluorescerande märkta siRNA. Vidare, vi fastställt att om 74% av alla regenererande myofibers var positiva för fluorescerande märkta siRNA tyder på att antingen 74% av regenererande myofibers hade tagit upp siRNA eller att siRNA-positiva satellit celler antingen hade smält med varandra för att bilda nya myofibers eller det fusion med redan existerande regenererande myofibers uppstod (figur 5). Detta tyder på att satellit celler tar upp självförsörjande siRNA och att siRNA kvarstår i satellit cellerna i minst två dagar.
Figur 1: injektion av kardiotoxin i tibialis främre muskel. A) möss anesthetiseras genom inandning av isofluran och den nedre extremiteten rakas. (B) en 29 G nål injiceras i tibialis främre muskel (C) och flyttas längs Tibia benet under injektion av cardiotoxin lösning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: steg som ingår i dissektion och frysning av den skadade tibialis främre muskeln. (A) musklerna i bakbenen exponeras (B) och fascian som omger tibialis främre muskeln är rippade för att exponera muskeln. (C) efter avlägsnande av muskeln, det skärs i mitten av magen regionen i två halvor av liknande storlek med vassa raka sax (D). (E) halvor av den dissekerade muskeln är inbäddade i en aluminiumfolie mögel fylld med frysning lösning och frysta i flytande kväve (F). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: utrustning och steg som ingår i kryosektionering av tibialis främre muskler. (A) kammartemperaturen i kryostaten är inställd på-21 ° c. B) tibialis främre muskel i frys lösningen monteras på provhållaren. C) avsnitten med 14 μm tjocklek är fästa vid glas Mikroskop diabilder. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: representativa bilder av regenererande tibialis främre muskler. H & E färgning av tibialis främre muskler före (a) och 7 dagar efter kardiotoxin skada (B). (C) i oskadade muskler Pax7 positiva (i röda) satellit celler är placerade under den basala lamina markerade med laminin (i grönt). Kärnor motfärgas med DAPI (i blått). Pax7 positiva celler markeras med en pil. (D) efter 10 dagar av förnyelse, myofibers kännetecknas av centralt belägna kärnor (i blått), Pax7 visas i rött, laminin i grönt. Pax7 positiva celler markeras med en pil. (E) nybildade myofibers Express utvecklingsmässiga myosin (i rött), laminin i grönt, kärnor motfärgas med DAPI (i blått). (F) fluorescerande märkt självförsörjande siRNA (sired, avbildat i rött) finns fortfarande i satellit celler (Pax7 positiva, i grönt, märkt med en pil i infälld) 2 dagar efter injektion av den självförsörjande siRNA till regenererande tibialis anterior (injektion dag 3 efter kardiotoxin-medierad skada). Laminin visas i vitt, kärnor motfärgas med DAPI (i blått). Skalstapel = 100 μm (A och B), 50 μm (C-E), 25 μm (F). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: kvantifiering av upptaget av Fluorescent märkt siRNA. (A) kvantifiering av siRNA upptag av satellit celler (Pax7 + celler) och regenererande myofibers 2 dagar efter injektion i regenererande skelettmuskulaturen. Injektion utfördes dag 3 efter kardiotoxin-medierad skada. n = 3, felstaplar visar SEM.B) kvantifiering som ligger till grund för grafen i a. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Här presenterar vi en metod för att undersöka funktionen hos en specifik gen under regenerering av skelettmuskulaturen utan behov av transgena djur. Detta åstadkoms genom kombinationen av kardiotoxin inducerad muskel skada med injektion av en självförsörjande siRNA i regenererande skelettmuskulaturen på dag 3 efter skada. Vi har beskrivit i detalj förfarandena för muskel skada av cardiotoxin, injektion av den självförsörjande siRNA och bearbetning av de skördade musklerna att analysera utvecklingen av förnyelse. Vi visar att injektion av ormen Venom cardiotoxin i skelettmuskulaturen effektivt skadar hela muskeln och att självförsörjande siRNAs finns i cirka 75% av alla satellit celler bland andra celltyper två dagar efter deras injektion i skelettmuskulaturen (figur 4, figur 5).
Särskild uppmärksamhet bör ägnas åt en homogen skada av tibialis främre muskel eftersom varierande grad av skada påverkar regenereringsresultatet och därmed även effekten av siRNA kan påverkas. Dessutom är det ytterst viktigt att hela regenererande området injiceras med själv leverans ande siRNA. För analys av regenereringsprocessen, det rekommenderas att alltid jämföra liknande områden av regenererande skelettmuskulaturen, därför bör tibialis främre muskeln skäras i hälften för att alltid jämföra mitten av magen regionen av muskeln. Vid analys av muskeln, hela kryosektionen måste analyseras eftersom myofiber sammansättningen skiljer sig i tibialis främre muskeln och kan därför regenerera annorlunda.
Funktionen av satellit celler kan undersökas genom olika experimentella förfaranden inklusive deras kultur på angränsande isolerade enda myofibers17, genom transplantation och genom att analysera förnyelse av skelettmuskulaturen efter inducerad skada 18,19. Undersöka funktionen av satellit celler med hjälp av en in vivo inducerad skada modell, t. ex., injektion av cardiotoxin, ger möjlighet att analysera satellit cell funktion även när det gäller deras interaktion med andra celltyper såsom makrofager och utredning av påverkan av systemiska faktorer2. Skada av skelettmuskulaturen kan åstadkommas med olika medel, e.g., excentrisk övning, frys skada, injektion av BaCl2 eller injektion av orm gifter såsom cardiotoxin eller notexin18. Medan excentrisk övning är förmodligen den mest fysiologiska skadan metod, skadan på en viss muskel är endast begränsad20. Frysskador kan tillämpas när migration av satellit celler mot platsen för skadan är syftet med studien eller endast en viss del av muskeln bör skadas. Experimentellt nackdelen med frysskador är den öppna kirurgi som måste utföras för att tillämpa den förtryckta metall sonden. Injektion av BaCl2 eller orm gifter är den mest dramatiska metoden för skada, vilket utmanande satellit cell funktion mest. Dessutom är injektionen minimalt invasiv, kirurgi tid, i allmänhet, är mindre än fem minuter och innebär inte suturering, etc. vilket minimerar risken för infektioner.
Muskel skada används främst för att undersöka de funktionella konsekvenserna av förlust av gen funktioner, t. ex., förlust av Pax77,21. Särskilt om åldrade möss är i fokus för den vetenskapliga frågan, är generering eller användning av transgena möss ofta inte genomförbart. Injektion av självförsörjande siRNAs som riktar sig mot en specifik gen är ett lönsamt alternativ i dessa fall och har använts framgångsrikt22. I korthet, tibialis främre muskeln av möss skadades genom injektion av cardiotoxin och Self-levererande sirnas riktade mot Fibronektin (FN) injicerades på dag 3 efter skada. Musklerna analyserades 10 dagar efter skada och en signifikant minskning av antalet satellit celler observerades i siFN kontra kodade siRNA kontrollförhållanden. Den knockdown effektivitet bestämdes i hela muskler celllysat av kvantitativa real tid PCR 2 dagar efter siRNA injektion, en minskning av uttrycks nivåer på 58% uppnåddes tyder på att leverans och knockdown effektivitet är tillräckliga för funktionella analyser22. Alternativ för att testa knockdown effektivitet är antingen immunoblot eller immunofluorescensanalyser med antikroppar riktade mot målgenen. Effektiviteten och specificiteten hos siRNA som används för in vivo injektioner bör bestämmas före injektion i möss, t. ex., genom att testa effektiviteten i isolerade satellit celler eller primära myoblasts. Användningen av en smart pool bestående av 4 olika siRNAs kontra en enda siRNA ökar effektiviteten av knockdown men ökar också risken för ospecifik inriktning. Specificiteten hos alla siRNA-sekvenser som används bör testas i cellkulturen för att undvika off-Target effekter. Som en kontroll, en icke-riktade kodade siRNA bör användas eftersom injektionen av en siRNA i sig kan påverka regenereringsprocessen på grund av injektion och därmed ytterligare skador på muskeln. Tidspunkten för injicering av siRNA beror på den vetenskapliga frågan och på uttrycks profilen för målgenen. Generellt, en injektion av självförsörjande siRNA på dag 3 efter kardiotoxin skada mål de flesta gener viktiga för satellit cell spridning sedan satellit cell spridning toppar runt dag 3 efter skada. Tidspunkten för den första siRNA injektion bör inte vara mindre än 48 h efter kardiotoxin skada eftersom injektionsvolymen av cardiotoxin är ganska hög och reabsorption av vätskan bör ha ägt rum innan du injicerar ytterligare lösningar i muskeln. I allmänhet är multipla injektioner av siRNAs eller en kombination av olika siRNAs möjligt även om man måste tänka på att varje injektion i regenererande muskeln orsakar ytterligare skador.
En begränsning av den beskrivna metoden är det faktum att den observerade effekten inte nödvändigtvis endast beror på knockdown av målgenen i satellit celler, men kan tillskrivas andra celltyper såsom immunceller eller fibro-adipogenic progenitorceller. Därför är det nödvändigt att kombinera dessa experiment med experiment som undersöker en ren population av satellit celler. Man kan antingen utföra experiment med flytande myofiber kulturer, där satellit celler odlas på deras angränsande myofibers eller utföra transplantations experiment med isolerade satellit celler17.
Ett alternativ till injektion av själv leverans ande siRNAs är injektion av småmolekylära hämmare eller rekombinanta proteiner som kan utföras, beroende på den vetenskapliga frågan. Till exempel, injektion av det extracellulära matrix proteinet Fibronektin eller små molekyler hämmare av Jak/stat signalering har framgångsrikt utförts i åldern möss15,16. Analysen av en viss genfunktion i en specifik celltyp vid regenerering av skelettmuskulaturen, t. ex., i satellit celler, är endast möjlig genom användning av en inducerbar genetisk musmodell. Injektioner av självförsörjande siRNAs, rekombinanta proteiner eller små molekyler hämmare kan påverka flera celltyper i regenererande skelettmuskulaturen.
Disclosures
Vi vill tacka Christina Picker och Christine poser för utmärkt tekniskt bistånd och Saskia Steiner för att få hjälp med bestämning av siRNA transfection effektivitet. Vi tackar Core Service histologi för stor teknisk support, särskilt Sabine Landmann och Linda Rothenburger. Vi tackar också djuranläggningen musen på FLI för utmärkt stöd. Detta arbete stöddes av bidrag från Deutsche Forschungsgemeinschaft (MA-3975/2-1) och Deutsche Krebshilfe (DKH-JvM-861005) till J.v.M.
Acknowledgments
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Henry Schein | Isothesia | inhalation narcotics |
| Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
| Anesthesia System (Tec 7) with inhalation box + nose masks | Tem Sega | Minihub | |
| Shaver for rodents | isis | GT420 | |
| Cardiotoxin | Latoxan | L8102 | snake venom needed for muscle injury |
| Accell siRNA smart pool | Dharmacon | depending on your target gene | self delivering siRNA |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A-21206 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher | A-21123 | secondary antibody |
| Coverslips | VWR | 631-1574 | |
| CV Mount | Leica | 14046430011 | mounting medium for immunohistochemistry |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | nuclear staining |
| devMHC antibody | DHSB | F.1652 | |
| Eosin Y | Thermo Fisher | 73104 | |
| Haematoxylin Gill No3 | Sigma-Aldrich | GHS316-500ML | |
| Insulin syringe (29 g) | Terumo | 3SS05M2813 | syringue used for muscle injections |
| Laminin antibody | Sigma Aldrich | L9393 | |
| M.O.M blocking reagent | Vector labs | MKB-2213 | blocking for immunofluorescent staining |
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | Metacam | analgesics |
| OCT | Thermo Fisher | 6502 | tissue embedding |
| Pax7 antibody | DSHB | PAX7 | satellite cell specific antibody |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher | P36934 | aequos mounting medium |
| Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | tissue embedding |
| Superfrost plus | Thermo Scientific | J1830AMNZ | microscope slides |
| TritonX-100 | Amresco | 0694-1L | permeabilization reagent |
| Dissection tools | |||
| Dumont 5, straight | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Dumont 7, curved | Fine Science Tools | 11272-40 | |
| Extra fine Bonn scissors (cutting edge: 13 mm) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Narrow pattern forceps | Fine Science Tools | 11002-16 | |
| Spring scissors (cutting edge: 5 mm, tip diameter: 0.35 mm) | Fine Science Tools | 91500-09 |
References
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- Schmidt, M., Schuler, S. C., Huttner, S. S., von Eyss, B., von Maltzahn, J. Adult stem cells at work: regenerating skeletal muscle. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2019).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytolology. 9, 493-495 (1961).
- Shea, K. L., et al. Sprouty1 regulates reversible quiescence of a self-renewing adult muscle stem cell pool during regeneration. Cell Stem Cell. 6 (2), 117-129 (2010).
- von Maltzahn, J., Jones, A. E., Parks, R. J., Rudnicki, M. A. Pax7 is critical for the normal function of satellite cells in adult skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America U S A. 110 (41), 16474-16479 (2013).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
- Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. A. Satellite cells and the muscle stem cell niche. Physiological Reviews. 93 (1), 23-67 (2013).
- Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Building muscle: molecular regulation of myogenesis. Cold Spring Harb Perspectives in Biology. 4 (2), (2012).
- Schworer, S., et al. Epigenetic stress responses induce muscle stem-cell ageing by Hoxa9 developmental signals. Nature. 540 (7633), 428-432 (2016).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
- von Maltzahn, J., Renaud, J. M., Parise, G., Rudnicki, M. A. Wnt7a treatment ameliorates muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America U S A. 109 (50), 20614-20619 (2012).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nature Medicine. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- Lukjanenko, L., et al. Loss of fibronectin from the aged stem cell niche affects the regenerative capacity of skeletal muscle in mice. Nature Medicine. 22 (8), 897-905 (2016).
- Huttner, S. S., et al. Isolation and Culture of Individual Myofibers and Their Adjacent Muscle Stem Cells from Aged and Adult Skeletal Muscle. Methods in Molecular Biology. , (2019).
- Hardy, D., et al. Comparative Study of Injury Models for Studying Muscle Regeneration in Mice. PLoS One. 11 (1), e0147198 (2016).
- Hall, M. N., et al. Transplantation of Skeletal Muscle Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1556, 237-244 (2017).
- Dueweke, J. J., Awan, T. M., Mendias, C. L. Regeneration of Skeletal Muscle After Eccentric Injury. Journal of Sport Rehabilitation. 26 (2), 171-179 (2017).
- Lepper, C., Conway, S. J., Fan, C. M. Adult satellite cells and embryonic muscle progenitors have distinct genetic requirements. Nature. 460 (7255), 627-631 (2009).
- Bentzinger, C. F., et al. Fibronectin regulates Wnt7a signaling and satellite cell expansion. Cell Stem Cell. 12 (1), 75-87 (2013).
