Obtention af gigantiske Unilamellar hybrid vesikler ved elektro dannelse og måling af deres mekaniske egenskaber ved mikropipette aspiration
Summary
Målet med protokollen er at pålideligt måle membran mekaniske egenskaber af gigantiske vesikler ved mikropipette aspiration.
Abstract
Gigantiske vesikler fra phospholipider og copolymere kan udnyttes i forskellige anvendelser: kontrolleret og målrettet lægemiddel levering, biomolekulær genkendelse inden for biosensorer til diagnosticering, funktionelle membraner til kunstige celler og udvikling af bioinspirerede mikro/nano-reaktorer. I alle disse applikationer er karakteriseringen af deres membran egenskaber af fundamental betydning. Blandt eksisterende karakterisering teknikker, mikropipette aspiration, pioneret af E. Evans, gør det muligt at måle mekaniske egenskaber af membranen såsom område komprimerbarhed modulus, bøjning modulus og lysis stress og stamme. Her præsenterer vi alle de metoder og detaljerede procedurer for at opnå gigantiske vesikler fra den tynde film af en lipid eller copolymer (eller begge), fremstilling og overfladebehandling af Mikropipetter, og aspiration procedure, der fører til måling af alle de parametre, der tidligere er nævnt.
Introduction
Gigantiske vesikler opnået fra phospholipider (Liposomer) har været meget anvendt siden 1970 ‘ erne som den grundlæggende celle membran model1. I slutningen af 1990 ‘erne,vesikulære morfologier opnået fra den selv-samling af Copolymerer, kaldes polymersomer med henvisning til deres lipid analoger2,3, hurtigtdukkede op som et interessant alternativ til Liposomer, der besidder svag mekanisk stabilitet og dårlig modulære kemiske funktionalitet. Men, deres celle biomimetic karakter er temmelig begrænset i forhold til Liposomer da sidstnævnte er sammensat af phospholipider, den vigtigste komponent i cellemembranen. Desuden kan deres lave membran permeabilitet være et problem i nogle applikationer som lægemiddel levering, hvor kontrolleret diffusion af arter gennem membranen er påkrævet. For nylig har sammenslutningen af phospholipid’er med blok copolymere til at designe hybrid polymer-lipid vesikler og membraner været genstand for et stigende antal undersøgelser4,5. Hovedidéen er at designe enheder, der synergistisk kombinerer fordelene ved hver komponent (Bio-funktionalitet og permeabilitet af lipid-dobbeltlag med mekanisk stabilitet og kemisk alsidighed af polymer membraner), som kan udnyttes i forskellige anvendelser: kontrolleret og målrettet lægemiddel levering, biomolekulær genkendelse inden for biosensorer til diagnosticering, funktionelle membraner til kunstige celler, udvikling af bio-inspirerede mikro-/nano-Reactors.
I dag, forskellige videnskabelige samfund (biokemikere, kemikere, biophysicister, fysisk-kemikere, biologer) har stigende interesse i udvikling af en mere avanceret celle membran model. Her er vores mål at præsentere, så detaljeret som muligt, eksisterende metoder (elektro dannelse, mikropipette aspiration) for at opnå og karakterisere de mekaniske egenskaber af gigantiske vesikler og de seneste “avancerede” celle membran modeller, der er hybrid polymer lipid gigantiske vesikler4,5.
Formålet med disse metoder er at opnå pålidelig måling af områdets kompressionsevne og bøjning moduli af membranen samt deres lysis stress og stamme. En af de mest almindelige teknikker, der findes til at måle bøjning stivhed af en kæmpe vesikelprotein er udsvings analyse6,7, baseret på direkte video mikroskop observation; men dette kræver store synlige membran udsving, og er ikke systematisk opnået på tykke membraner (f. eks. polymersomer). Område Komprimerbar modulus kan eksperimentelt bestemmes ved hjælp af Langmuir Blodgett teknik, men oftest på en enkeltlags8. Den mikropipette aspiration teknik gør det muligt at måle begge moduli på en tolags danner Giant af vesikelprotein (GUV) i et eksperiment.
Følgende metode er hensigtsmæssig for alle amfifilic molekyler eller makromolekyle, der kan danne dobbeltlag og dermed vesikler ved elektro dannelse. Dette kræver en flydende karakter af den tolags ved temperaturen af elektro dannelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Belægningen af mikropipetten er et af de vigtigste punkter for at opnå pålidelige målinger. Adhæsion af vesikel til mikropipetten skal forhindres, og en belægning er almindeligt anvendt i litteratur17,18,19,20,21, med BSA, β-Casein eller surfasil. Detaljer om belægningen procedure er sjældent nævnt.
Opløsningen af BSA ska…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkender taknemmeligt ANR for finansiel støtte (ANR sysa).
Materials
| Required equipment and materials for micropipette design | |||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | external and internal diameter of 1mm and 0.58 mm respectively. |
| Filament installed | Sutter Instrument Co. | FB255B | 2.5mm*2.5mm Box Filament |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | |
| Microforge | NARISHGE Co. | MF-900 | fitted with two objectives (10x and 32x) |
| Materials for coating pipette tips with BSA | |||
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Sigma-Aldrich | 10735078001 | |
| Disposable 1 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.1612 | |
| Disposable 10 ml syringe Luer Tip | Codan | 626616 | |
| Disposable 5 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.5607 | |
| Disposable acetate cellulose filter | Cluzeau Info Labo | L5003SPA | Pore size: 0.22µm, diameter: 25mm |
| Flexible Fused Silica Capillary Tubing | Polymicro Technologies. | TSP530660 | Inner Diameter 536µm, Outer Diameter 660µm, |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Syringe 500 µL luer Lock GASTIGHT | Hamilton Syringe Company | 1750 | |
| Test tube rotatory mixer | Labinco | 28210109 | |
| Micromanipulation Set up | |||
| Aluminum Optical Rail, 1000 mm Length, M4 threads, X48 Series | Newport | ||
| Damped Optical Table | Newport | used as support of microscope to prevent external vibrations. | |
| Micromanipulator | Eppendorf | Patchman NP 2 | The module unit (motor unit for X, Y and Z movement) is mounted on the inverted microscope by the way of an adapter. |
| Micrometer | Mitutoyo Corporation | 350-354-10 | Digimatic LCD Micrometer Head 25,4 mm Range 0,001 mm |
| Plexiglass water reservoir (100 ml) | Home made | ||
| TCS SP5 inverted confocal microscope (DMI6000) equipped with a resonant scanner and a water immersion objective (HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I). | Leica | ||
| X48 Rail Carrier 80 mm Length,with 1/4-20, 8-32 and 4-40 thread | Newport | ||
| Materials for sucrose and amphiphile solution preparation | |||
| 2-Oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Sigma-Aldrich | ||
| Chloroform | VWR | 22711.244 | |
| L-α-Phosphatidylethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) | Sigma-Aldrich | 810146C | Rhodamine tagged lipid |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Electroformation set up | |||
| 10 µL glass capillary ringcaps | Hirschmann | 9600110 | |
| Disposable 1 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.1612 | |
| H Grease | Apiezon | Apiezon H Grease | Silicon-free grease |
| Indium tin oxide coated glass slides | Sigma-Aldrich | 703184 | |
| Needle | Terumo | AN2138R1 | 0.8 x 38 mm |
| Ohmmeter (Multimeter) | Voltcraft | VC140 | |
| Toluene | VWR | 28676.297 | |
| Voltage generator | Keysight | 33210A |
References
- Bangham, A. D., Standish, M. M., Watkins, J. C. Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids. Journal of Molecular Biology. 13 (1), (1965).
- Discher, D. E., Eisenberg, A. Polymer vesicles. Science. 297 (5583), 967-973 (2002).
- Hammer, D., et al. Polymersomes: vesicles from block copolymers. Annals of Biomedical Engineering. 28 (SUPPL. 1), (2000).
- Le Meins, J. F., Schatz, C., Lecommandoux, S., Sandre, O. Hybrid polymer/lipid vesicles: state of the art and future perspectives. Materials Today. 16 (10), 397-402 (2013).
- Schulz, M., Binder, W. H. Mixed Hybrid Lipid/Polymer Vesicles as a Novel Membrane Platform. Macromolecular Rapid Communications. 36, 2031-2041 (2015).
- Schneider, M. B., Jenkins, J. T., Webb, W. W. Thermal fluctuations of large quasi-spherical bimolecular phospholipid vesicles. Journal De Physique. 45 (9), 1457-1472 (1984).
- Dimova, R. Recent developments in the field of bending rigidity measurements on membranes. Advances in Colloid and Interface Science. 208, 225-234 (2014).
- Rodríguez-García, R., et al. Polymersomes: smart vesicles of tunable rigidity and permeability. Soft Matter. 7 (4), 1532-1542 (2011).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
- Dao, T. P. T., et al. Membrane properties of giant polymer and lipid vesicles obtained by electroformation and pva gel-assisted hydration methods. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 533, 347-353 (2017).
- Pereno, V., et al. Electroformation of Giant Unilamellar Vesicles on Stainless Steel Electrodes. ACS omega. 2 (3), 994-1002 (2017).
- Evans, E., Rawicz, W. Entropy-driven tension and bending elasticity in condensed-fluid membranes. Physical Review Letters. 64 (17), 2094-2097 (1990).
- Dao, T. P. T., et al. Modulation of phase separation at the micron scale and nanoscale in giant polymer/lipid hybrid unilamellar vesicles (GHUVs). Soft Matter. 13 (3), 627-637 (2017).
- Helfrich, W. Elastic properties of lipid bilayers: theory and possible experiments. Z Naturforsch C. 11 (11), 693-703 (1973).
- Dao, T. P. T., et al. The combination of block copolymers and phospholipids to form giant hybrid unilamellar vesicles (GHUVs) does not systematically lead to "intermediate” membrane properties. Soft Matter. 14 (31), 6476-6484 (2018).
- Shoemaker, S. D., Kyle Vanderlick, T. Material Studies of Lipid Vesicles in the Lα and Lα-Gel Coexistence Regimes. Biophysical Journal. 84 (2), 998-1009 (2003).
- Longo, M. L., Ly, H. V., Dopico, A. M. . Methods in Membrane Lipids. , 421-437 (2007).
- Chen, D., Santore, M. M. Hybrid copolymer-phospholipid vesicles: phase separation resembling mixed phospholipid lamellae, but with mechanical stability and control. Soft Matter. 11 (13), 2617-2626 (2015).
- Mabrouk, E., et al. Formation and material properties of giant liquid crystal polymersomes. Soft Matter. 5, 1870-1878 (2009).
- Henriksen, J., et al. Universal behavior of membranes with sterols. Biophysical Journal. 90 (5), 1639-1649 (2006).
- Ly, H. V., Block, D. E., Longo, M. L. Interfacial Tension Effect of Ethanol on Lipid Bilayer Rigidity, Stability, and Area/Molecule: A Micropipet Aspiration Approach. Langmuir. 18 (23), 8988-8995 (2002).
- Bermudez, H., Hammer, D. A., Discher, D. E. Effect of Bilayer Thickness on Membrane Bending Rigidity. Langmuir. 20, 540-543 (2004).
