Dev Unilamellar Hibrid Veziküllerin Elektroformasyon ile Obtention ve Mikropipet Aspirasyon ile Mekanik Özelliklerinin Ölçümü
Summary
Protokolün amacı, dev veziküllerin membran mekanik özelliklerini mikropipet aspirasyonu ile güvenilir bir şekilde ölçmektir.
Abstract
Fosfolipidlerden ve kopolimerlerden elde edilen dev veziküller farklı uygulamalarda kullanılabilir: kontrollü ve hedefli ilaç dağıtımı, tanı için biyosensörler içinde biyomoleküler tanıma, yapay hücreler için fonksiyonel membranlar ve biyoilham mikro/nano-reaktörlerin geliştirilmesi. Tüm bu uygulamalarda membran özelliklerinin karakterizasyonu temel önemtaşımaktadır. Mevcut karakterizasyon teknikleri arasında, E. Evans’ın öncülük ettiği mikropipet aspirasyonu, membranın alan sıkıştırılabilirlik modülü, bükme modülü ve lysis gerilimi ve gerilme gibi mekanik özelliklerinin ölçülmesine olanak sağlar. Burada, bir lipid veya kopolimerin ince filmden (veya her ikisinden) dev veziküller elde etmek için tüm metodolojileri ve ayrıntılı prosedürleri, mikropipetlerin üretim ve yüzey işlemesini ve daha önce bahsedilen tüm parametrelerin ölçülmelerine yol açan aspirasyon prosedürünü saklı atıyoruz.
Introduction
Fosfolipidlerden elde edilen dev veziküller (lipozomlar) 1970’lerden beri temel hücre zarı modeli1olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. 1990’ların sonlarında, kopolimerlerin kendi kendine biraraya gelen vesiküler morfolojileri, lipid analoglarına referans olarak polimeromlar olarak adlandırılan2,3, hızla zayıf mekanik stabilite ve zayıf modüler kimyasal işlevselliğe sahip lipozomlara ilginç bir alternatif olarak ortaya çıkmıştır. Ancak, ikinci fosfolipidler oluşur beri onların hücre biyomimetik karakteri oldukça lipozomlar ile karşılaştırıldığında sınırlıdır, hücre zarının ana bileşeni. Ayrıca, düşük membran geçirgenliği, zar dan türlerin kontrollü difüzyonunun gerekli olduğu ilaç dağıtımı gibi bazı uygulamalarda sorun olabilir. Son zamanlarda, blok kopolimerler ile fosfolipidlerin ilişki melez polimer-lipid veziküller ve membranlar tasarımı çalışmaların artan sayıda konu olmuştur4,5. Ana fikir sinerjik her bileşenin yararları birleştirmek varlıklar tasarlamaktır (biyo-işlevsellik ve polimer membranların mekanik istikrar ve kimyasal çok yönlülük ile lipid bilayers geçirgenlik), hangi farklı uygulamalarda istismar edilebilir: kontrollü ve hedefli ilaç teslimatı, tanı için biyosensörler içinde biyomoleküler tanıma, yapay hücreler için fonksiyonel membranlar, biyo-ilham mikro-nano-reaktörlerin geliştirilmesi.
Günümüzde, farklı bilimsel topluluklar (biyokimyacılar, kimyagerler, biyofizikçiler, fiziko-kimyagerler, biyologlar) daha gelişmiş bir hücre zarı modelinin geliştirilmesine olan ilgiartmaktadır. Burada, amacımız, mümkün olduğunca ayrıntılı olarak, mevcut metodolojileri (elektroformasyon, mikropipette aspirasyon) elde etmek ve dev veziküllerin mekanik özellikleri ve hibrid polimer lipid dev veziküller olan son “gelişmiş” hücre zarı modelleri karakterizesunmaktır 4,5.
Bu yöntemlerin amacı, membranın alan sıkıştırılabilirliğinin ve bükülme modulisinin güvenilir bir şekilde ölçülmesinin yanı sıra, membranın lysis gerilimi ve gerilmelerinin güvenilir bir şekilde ölçülmesini sağlamaktır. Dev bir vezikül bükme sertliğini ölçmek için mevcut en yaygın tekniklerden biri dalgalanma analizi6,7, doğrudan video mikroskop gözlemdayalı; ancak bu büyük görünür membran dalgalanması gerektirir ve kalın membranlar (örn. polimeromlar) üzerinde sistematik olarak elde edilmez. Alan sıkıştırılabilirlik modülü deneysel Langmuir Blodgett tekniği kullanılarak belirlenebilir ama en sık bir monolayer8. Mikropipet aspirasyon tekniği, bir deneyde dev unilamellar vezikül (GUV) oluşturan iki katmanlı bir modüler in ölçülmesine olanak sağlar.
Aşağıdaki yöntem, iki katmanlı ve dolayısıyla elektroformasyon ile veziküller oluşturabilen tüm amfilik moleküller veya makromoleküller için uygundur. Bu elektroformasyon sıcaklığında iki katmanlı bir sıvı karakteri gerektirir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikropipetin kaplaması güvenilir ölçümler elde etmek için önemli noktalardan biridir. Mikropipet vezikül yapışması önlenmelidir, ve bir kaplama yaygın literatürde kullanılır17,18,19,20,21, BSA ile, β-kazein veya surfasil. Kaplama prosedürünün ayrıntıları nadiren belirtilir.
BSA’nın çözülmesi iyi bir isolif…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar minnetle mali destek (ANR Sysa) için ANR kabul.
Materials
| Required equipment and materials for micropipette design | |||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | external and internal diameter of 1mm and 0.58 mm respectively. |
| Filament installed | Sutter Instrument Co. | FB255B | 2.5mm*2.5mm Box Filament |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | |
| Microforge | NARISHGE Co. | MF-900 | fitted with two objectives (10x and 32x) |
| Materials for coating pipette tips with BSA | |||
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Sigma-Aldrich | 10735078001 | |
| Disposable 1 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.1612 | |
| Disposable 10 ml syringe Luer Tip | Codan | 626616 | |
| Disposable 5 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.5607 | |
| Disposable acetate cellulose filter | Cluzeau Info Labo | L5003SPA | Pore size: 0.22µm, diameter: 25mm |
| Flexible Fused Silica Capillary Tubing | Polymicro Technologies. | TSP530660 | Inner Diameter 536µm, Outer Diameter 660µm, |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Syringe 500 µL luer Lock GASTIGHT | Hamilton Syringe Company | 1750 | |
| Test tube rotatory mixer | Labinco | 28210109 | |
| Micromanipulation Set up | |||
| Aluminum Optical Rail, 1000 mm Length, M4 threads, X48 Series | Newport | ||
| Damped Optical Table | Newport | used as support of microscope to prevent external vibrations. | |
| Micromanipulator | Eppendorf | Patchman NP 2 | The module unit (motor unit for X, Y and Z movement) is mounted on the inverted microscope by the way of an adapter. |
| Micrometer | Mitutoyo Corporation | 350-354-10 | Digimatic LCD Micrometer Head 25,4 mm Range 0,001 mm |
| Plexiglass water reservoir (100 ml) | Home made | ||
| TCS SP5 inverted confocal microscope (DMI6000) equipped with a resonant scanner and a water immersion objective (HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I). | Leica | ||
| X48 Rail Carrier 80 mm Length,with 1/4-20, 8-32 and 4-40 thread | Newport | ||
| Materials for sucrose and amphiphile solution preparation | |||
| 2-Oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Sigma-Aldrich | ||
| Chloroform | VWR | 22711.244 | |
| L-α-Phosphatidylethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) | Sigma-Aldrich | 810146C | Rhodamine tagged lipid |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Electroformation set up | |||
| 10 µL glass capillary ringcaps | Hirschmann | 9600110 | |
| Disposable 1 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.1612 | |
| H Grease | Apiezon | Apiezon H Grease | Silicon-free grease |
| Indium tin oxide coated glass slides | Sigma-Aldrich | 703184 | |
| Needle | Terumo | AN2138R1 | 0.8 x 38 mm |
| Ohmmeter (Multimeter) | Voltcraft | VC140 | |
| Toluene | VWR | 28676.297 | |
| Voltage generator | Keysight | 33210A |
References
- Bangham, A. D., Standish, M. M., Watkins, J. C. Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids. Journal of Molecular Biology. 13 (1), (1965).
- Discher, D. E., Eisenberg, A. Polymer vesicles. Science. 297 (5583), 967-973 (2002).
- Hammer, D., et al. Polymersomes: vesicles from block copolymers. Annals of Biomedical Engineering. 28 (SUPPL. 1), (2000).
- Le Meins, J. F., Schatz, C., Lecommandoux, S., Sandre, O. Hybrid polymer/lipid vesicles: state of the art and future perspectives. Materials Today. 16 (10), 397-402 (2013).
- Schulz, M., Binder, W. H. Mixed Hybrid Lipid/Polymer Vesicles as a Novel Membrane Platform. Macromolecular Rapid Communications. 36, 2031-2041 (2015).
- Schneider, M. B., Jenkins, J. T., Webb, W. W. Thermal fluctuations of large quasi-spherical bimolecular phospholipid vesicles. Journal De Physique. 45 (9), 1457-1472 (1984).
- Dimova, R. Recent developments in the field of bending rigidity measurements on membranes. Advances in Colloid and Interface Science. 208, 225-234 (2014).
- Rodríguez-García, R., et al. Polymersomes: smart vesicles of tunable rigidity and permeability. Soft Matter. 7 (4), 1532-1542 (2011).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
- Dao, T. P. T., et al. Membrane properties of giant polymer and lipid vesicles obtained by electroformation and pva gel-assisted hydration methods. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 533, 347-353 (2017).
- Pereno, V., et al. Electroformation of Giant Unilamellar Vesicles on Stainless Steel Electrodes. ACS omega. 2 (3), 994-1002 (2017).
- Evans, E., Rawicz, W. Entropy-driven tension and bending elasticity in condensed-fluid membranes. Physical Review Letters. 64 (17), 2094-2097 (1990).
- Dao, T. P. T., et al. Modulation of phase separation at the micron scale and nanoscale in giant polymer/lipid hybrid unilamellar vesicles (GHUVs). Soft Matter. 13 (3), 627-637 (2017).
- Helfrich, W. Elastic properties of lipid bilayers: theory and possible experiments. Z Naturforsch C. 11 (11), 693-703 (1973).
- Dao, T. P. T., et al. The combination of block copolymers and phospholipids to form giant hybrid unilamellar vesicles (GHUVs) does not systematically lead to "intermediate” membrane properties. Soft Matter. 14 (31), 6476-6484 (2018).
- Shoemaker, S. D., Kyle Vanderlick, T. Material Studies of Lipid Vesicles in the Lα and Lα-Gel Coexistence Regimes. Biophysical Journal. 84 (2), 998-1009 (2003).
- Longo, M. L., Ly, H. V., Dopico, A. M. . Methods in Membrane Lipids. , 421-437 (2007).
- Chen, D., Santore, M. M. Hybrid copolymer-phospholipid vesicles: phase separation resembling mixed phospholipid lamellae, but with mechanical stability and control. Soft Matter. 11 (13), 2617-2626 (2015).
- Mabrouk, E., et al. Formation and material properties of giant liquid crystal polymersomes. Soft Matter. 5, 1870-1878 (2009).
- Henriksen, J., et al. Universal behavior of membranes with sterols. Biophysical Journal. 90 (5), 1639-1649 (2006).
- Ly, H. V., Block, D. E., Longo, M. L. Interfacial Tension Effect of Ethanol on Lipid Bilayer Rigidity, Stability, and Area/Molecule: A Micropipet Aspiration Approach. Langmuir. 18 (23), 8988-8995 (2002).
- Bermudez, H., Hammer, D. A., Discher, D. E. Effect of Bilayer Thickness on Membrane Bending Rigidity. Langmuir. 20, 540-543 (2004).
