Summary
Astrocytter er morfologisk komplekse celler, som er et eksempel på flere prosesser og buskete territorier. For å analysere deres forseggjort morfologi, presenterer vi en pålitelig protokoll for å utføre intracellulære Lucifer gul Iontoforese i lett fast vev.
Abstract
Astrocytter er essensielle komponenter av nevrale kretser. De flis hele sentralnervesystemet (CNS) og er involvert i en rekke funksjoner, som inkluderer signalstoffet klaring, ion regulering, Synaptic modulering, metabolsk støtte til neurons, og blodstrøm regulering. Astrocytter er komplekse celler som har en Soma, flere store grener, og mange fine prosesser som kontakter ulike cellulære elementer innenfor neuropil. For å vurdere morfologi av astrocytter, er det nødvendig å ha en pålitelig og reproduserbar metode for å visualisere deres struktur. Vi rapporterer en pålitelig protokoll for å utføre intracellulære Iontoforese av astrocytter ved hjelp av fluorescerende Lucifer gul (LY) fargestoff i lett fast hjernevev fra voksen mus. Denne metoden har flere funksjoner som er nyttige for å karakterisere astrocytt morfologi. Det gir mulighet for tredimensjonal rekonstruksjon av individuelle astrocytter, som er nyttig å utføre morfologiske analyser på ulike aspekter av deres struktur. Immunhistokjemi sammen med LY-Iontoforese kan også benyttes for å forstå samspillet mellom astrocytter med ulike komponenter i nervesystemet og for å evaluere uttrykket av proteiner innenfor de merkede astrocytter. Denne protokollen kan implementeres i en rekke musemodeller av CNS lidelser for å grundig undersøke astrocytt morfologi med lys mikroskopi. LY Iontoforese gir en eksperimentell tilnærming for å evaluere astrocytt struktur, spesielt i sammenheng med skade eller sykdom der disse cellene er foreslått å gjennomgå betydelige morfologiske endringer.
Introduction
Astrocytter er de mest tallrike gliacellene cellene i det sentrale nervesystemet (CNS). De spiller roller i ion homeostase, blodstrøm regulering, synapse formasjon, samt eliminering, og signalstoffet opptak1. Det store utvalget av astrocytt funksjoner gjenspeiles i deres komplekse morfologiske struktur2,3. Astrocytter inneholder flere primære og sekundære grener som deler seg inn i tusenvis av finere branchlets og brosjyrer som direkte samhandler med synapser, dendrites, axons, blodkar og andre gliacellene celler. Astrocytt morfologi varierer på tvers av ulike hjerneregioner, noe som kan hint på deres evne til å utføre sine funksjoner differensielt i neuronal kretser4. Videre er astrocytter kjent for å endre sin morfologi under utvikling, under fysiologiske forhold, og i flere sykdomstilstander3,5,6.
En konsistent, reproduserbar metode er nødvendig for å nøyaktig løse kompleksiteten av astrocytt morfologi. Tradisjonelt har immunhistokjemi blitt brukt til å visualisere astrocytter med bruk av astrocytt spesifikke eller astrocytt beriket protein markører. Disse metodene avslører imidlertid mønsteret av protein uttrykk i stedet for astrocytt struktur. De brukte markører, for eksempel gliacellene fibrillary surt protein (GFAP) og S100 kalsium bindende protein β (S100β), ikke uttrykker i hele celle volumet og dermed ikke løse komplett morfologi7. Genetiske tilnærminger for å uttrykke fluorescerende proteiner overalt i astrocytter (virale injeksjoner eller transgene mus reporter linjer) kan identifisere finere grener og generelle territorium. Det er imidlertid vanskelig å differensiere individuelle astrocytter, og analysene kan være partisk av den astrocytt befolkningen som er målrettet mot den spesifikke arrangøren8. Serial § elektron mikroskopi har blitt brukt til å avdekke et detaljert bilde av interaksjoner av astrocytt prosesser med synapser. På grunn av tusenvis av astrocytt prosesser som kontakter synapser, er det for øyeblikket ikke mulig å rekonstruere en hel celle med denne teknikken9, selv om dette er forventet å endre med bruk av maskin læringstilnærminger for dataanalyse.
I denne rapporten fokuserer vi på en prosedyre for å karakterisere muse astrocytter ved hjelp av intracellulære Iontoforese med Lucifer gul (LY) fargestoff, ved hjelp av CA1 stratum radiatum som et eksempel. Metoden er basert på banebrytende tidligere arbeid av Eric Bushong og Markus Ellisman10,11. Astrocytter fra lett faste hjerne skiver identifiseres av deres karakteristiske Soma form og fylt med LY. Cellene blir deretter avbildet med konfokalmikroskopi mikroskopi. Vi demonstrerer hvordan LY-Iontoforese kan brukes til å rekonstruere individuelle astrocytter og utføre detaljerte morfologiske analyser av deres prosesser og territorium. Denne metoden kan også brukes sammen med immunhistokjemi for å identifisere romlige forhold og interaksjoner mellom astrocytter og neurons, andre gliacellene celler, og hjernen blodkar. Vi anser ly Iontoforese å være et svært egnet verktøy for å analysere morfologi i ulike hjernen regioner og mus modeller av sunne eller sykdom forhold7,12,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyret eksperimenter i denne studien ble utført i samsvar med National Institute of Health guide for omsorg og bruk av laboratorium dyr og ble godkjent av kansler ' s Animal Research Committee ved University of California, Los Angeles. Voksne mus (6 − 8 uker gammel) av blandet kjønn ble brukt i alle eksperimenter.
1. klargjøring av løsning
-
Kunstig spinalvæske (ACSF) løsning
- Forbered frisk ACSF-løsning (135 mm NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 14,7 mm NaHCO3, 11 mm D-glukose, 1,25 mm na2HPO4og 2 mm CaCl2) før hvert eksperiment. Legg MgCl2 og CaCl2 i det siste trinnet. Oppløse komponentene i høy kvalitet deionisert vann.
- Ruge ACSF-løsningen ved 35 ° c i et vannbad og boble med 95% O2/5% co2 i minst 30 min før eksperimentet.
- Tilsett 2% lidokain hydrochloride for å nå en endelig konsentrasjon på 0,02% i ACSF (i 100 mL).
-
Bindemiddel løsning
- Bruk 10% formalin bufret fosfat.
-
LY-oppløsning
- Forbered 1,5% LY-Dye-oppløsning ved å oppløse LY CH Dilithium salt eller LY CH inosinsyre salt i 5 mM KCl. Vortex grundig. Et volum på 1 mL er tilstrekkelig for flere eksperimenter.
- Sentrifuger for 10 min ved 16 800 x g. Deretter filtrerer du supernatanten med et sprøyte filter på 0,2 μm inn i et nytt rør. Alikvoter kan oppbevares ved 4 ° c i opptil 3 måneder.
Merk: Det er viktig å sentrifuger og filtrere fargestoff løsningen for å hindre aggregering av fargestoff partiklene, som kan tette elektroden.
2. mus Transcardial og hjerne disseksjon
-
Utarbeidelse av utstyr og mus for transcardial
Merk: C57/BL6 mus av begge kjønn kan brukes. Det har blitt empirisk observert at for metoden å fungere pålitelig, er det viktig at musene ikke er eldre enn 3 måneder (6 − 8 uker gammel er ideell). Denne protokollen er beskrevet nedenfor. En ekstra referanse er gitt for mer informasjon14.- Fjern slange med ACSF-oppløsning for å fjerne eventuelle luftbobler i linjen. Sett opp kirurgi verktøy for bruk (pinsett, buet, stump saks, Iris saks).
- Dypt bedøve musen ved å sette den inn i en isoflurane induksjon kammer, etter å ha lagt 2 − 3 mL isoflurane til kammeret. Tillat 1 − 2 min for bedøvelse å tre i kraft. Sørg for at pusten ikke stopper.
- Test for tå klype refleks. Fortsett når musen ikke reagerer på smerte stimulans og refleks er fraværende. Sikre dyret i liggende posisjon med hodet plassert i puste membran med en tilførsel av 5% isoflurane i oksygen og lemmer og hale tapet ned inne i en kjemisk røyk hette.
-
Transcardial
- Bruk pinsett, løft opp huden under rib bur. Lag en 5 − 6 cm snitt med den buede, sløv saks gjennom huden for å avdekke bukhulen. Skjær oppover gjennom bukveggen til lever og membran er synlige.
- Beveg forsiktig leveren bort fra diagrammet. Med Iris saks, lage en 3 − 4 cm lateral snitt i membranen.
- Skjær gjennom ribbeinet buret langs begge sider av kroppen for å avdekke brystet hulrom. Vær forsiktig så du ikke skader hjertet og unngå lungene. Løft brystbenet opp for å avdekke hjertet.
- Når hjertet er synlig, injisere 0,05 mL heparin natrium oppløsning (1 000 USP per mL) inn i venstre ventrikkel som en antikoagulerende. Deretter setter du inn en sprøyte nål forsiktig inn i venstre ventrikkel. Pass på at nålen forblir i ventrikkel og ikke Pierce gjennom til andre hjertekamre. Lag et lite snitt i riktig Atrium med Iris saks.
- Perfuse med ACSF-oppløsning med en hastighet på ca. 10 mL/min til væsken som finnes i kroppen, tømmes for blod (1 − 2 min).
- Bytt fra ACSF løsning til bindemiddel løsning uten å innføre noen luftbobler. Perfuse med bindemiddel løsning for 10 min ved 10 − 20 mL/min.
Forsiktig: Pass på at ingen bindemiddel løsning er drenering fra nesen. Dette indikerer at nålen nådde høyre ventrikkel og bindemiddel reiser til lungene i stedet for gjennom systemisk krets til resten av kroppen.
-
Disseksjon av hjernen
- Fjern hodet på musen med saks og nøye analysere ut musen hjernen fra skallen. Plasser i bindemiddel løsning for 1,5 h ved romtemperatur i en kort periode etter fiksering.
Merk: En god Iontoforese er nødvendig for vellykket LY. Hjernen skal være hvit-farget og fraværende av blod i hjernen blodkar. Kropp og lemmer skal virke stiv.
- Fjern hodet på musen med saks og nøye analysere ut musen hjernen fra skallen. Plasser i bindemiddel løsning for 1,5 h ved romtemperatur i en kort periode etter fiksering.
3. klargjøring av skive
-
Utarbeidelse av hippocampus skiver
- Vask hjernen med 0,1 M fosfat bufret saltvann (PBS) ved romtemperatur i 5 min. Tørk av hjernen med filter papir og fjern olfactory pære og lillehjernen med et skarpt barberblad.
- Monter hjernen på vibratome skuffen ved hjelp av Cyanoacrylate lim og fyll skuffen med PBS ved romtemperatur. Skjær hippocampus koronale seksjoner av 110 μm tykkelse.
Merk: Juster innstillingen for vibratome for å sikre at sektorene har samme tykkelse og jevn overflate. For dette eksperimentet ble det brukt en hastighetsinnstilling på 4,5 og en frekvensinnstilling på 8, som er vilkårlige innstillinger på instrumentet (tabell over materialer). Brukere må kanskje eksperimentere med innstillingene på andre enheter. - Samle seksjoner fra skuffen og plasser i en tallerken med PBS på isen.
4. forberedelse av elektroden
-
Forbered en skarp elektrode med passende motstand.
- Bruk en Borosilikatglass-elektrode med enkelt sylinder i glass med filament (OD 1,0 mm, ID 0,58 mm). Trekk en elektrode på en micropipette avtrekker (tabell med materialer). Ideelle elektroder fylt med 1,5% LY i 5 mM KCl bør ha en motstand av 200 MΩ når den plasseres i et bad av PBS.
Merk: Avtrekker innstilling varierer avhengig av apparat (type maskin som brukes og avtrekker filament). En høyere varme innstilling gir vanligvis lengre og finere tips. For micropipette avtrekker som brukes i dette eksperimentet, var innstillingene: varme: 317, pull: 90, hastighet: 70, og forsinkelse: 70. En bunn type filament ble brukt. - Oppbevar elektrodene i en lukket beholder for å hindre at støv kommer inn i spissen. Hold elektroder hevet fra bunnen av boksen for å hindre spissen fra å bryte.
- Bruk en Borosilikatglass-elektrode med enkelt sylinder i glass med filament (OD 1,0 mm, ID 0,58 mm). Trekk en elektrode på en micropipette avtrekker (tabell med materialer). Ideelle elektroder fylt med 1,5% LY i 5 mM KCl bør ha en motstand av 200 MΩ når den plasseres i et bad av PBS.
-
Fyll elektroden med LY farge løsning.
- Plasser en elektrode i vertikal posisjon med spissen vendt nedover. Pipetter 1 − 2 μL av LY-løsning på baksiden av elektroden og vent i 5 − 10 minutter for at løsningen skal gå til spissen via kapillær virkningen.
- Fest den fylte elektroden forsiktig i elektrodeholderen som er koblet til en manipulator.
Merk: Den sølvfargede ledningen på elektrodeholderen må være i kontakt med LY inne i elektroden. Juster volumet på LY-løsningen om nødvendig, avhengig av ledningslengden.
5. fylling astrocytter med Iontoforese
- Test elektroden.
- Plasser en hjerne skive forsiktig inn i et glassbunn parabolen fylt med 0,1 M PBS ved romtemperatur. Hold stykket på plass med en platina harpe med nylon strenger.
- Sørg for at elektroden er koblet til en spenningskilde og plasser jordelektroden i badet som inneholder hjerne stykket.
- Flytt målet til hjernen regionen av interesse.
- Senk elektroden inn i løsningen. Under den lyse feltet, flytte den til midten av synsfeltet og undersøke det nøye med 40x vann nedsenking linsen for å sikre at det ser klart og uten rusk eller bobler. Hvis det er noe som tetter elektrodespissen, Bytt den ut med en ny.
Merk: Tilstopping er en bekymring for 200 MΩ-elektroden. Med sentrifugering og filtrering av fargestoff løsningen før hvert eksperiment, bør dette ikke være et hyppig problem. Men fordi spissen av elektroden er liten, kan vevet noen ganger bli sittende fast i åpningen. Forfatterne har ikke funnet en måte å forhindre dette, men det kan lett håndteres ved å bruke en ny elektrode. - Observer spissen av elektroden under konfokalmikroskopi laser-skanning mikroskop med 488 NM laser. Deretter, test Dye utstøting ved å slå på stimulator ved 12 V. Legg merke til en stor fluorescerende farge Sky rundt spissen av elektroden mens stimulator er på. Hvis ingen eller lite fargestoff blir utløst ved spennings stimulering, Bytt ut elektroden.
- Under det lyse feltet, sakte senke elektroden mot stykket stopper like over overflaten.
- Fyll astrocytt med Iontoforese.
- Identifiser astrocytter 40 − 50 μm under skive overflaten med infra-rød differensial forstyrrelser kontrast (IR-DIC). Se etter celler med langstrakt, oval somata ca 10 μm i diameter. Når en astrocytt er valgt, flytter du den til midten av synsfeltet.
Merk: En god celle for Iontoforese har klare, definerte kanter rundt den. Ikke Velg celler for nær overflaten av stykket fordi de ikke kan fylles helt. Det tar litt praksis over et par dager for å være i stand til å rutinemessig identifisere astrocytter for fargestoff fylling. Antall astrocytter kan variere avhengig av hjerne området som brukes for eksperimentet. Dette kan påvirke tiden som er nødvendig for å identifisere en astrocytt før fylling. - Sakte senke elektrodespissen inn i stykket, navigerer gjennom vevet, til det er på samme plan som celle kroppen.
Merk: Beveg elektroden langsomt for å unngå skade på vevet. - Når celle legemet til astrocytt er godt synlig og skissert, langsomt og forsiktig forhånd elektroden fremover. Flytt elektroden til spissen Impales Soma av cellen. Flytt fokus for objektive langsomt opp og ned for å merke hvis elektroden er inne i Soma.
Merk: Elektroden spissen må være inne i cellen kroppen, og en liten fordypning på Soma bør overholdes. Ikke Beveg elektroden lenger for å unngå at spissen går gjennom cellen. - Når elektrodespissen er inne i cellen, slår du på stimulator på ~ 0,5 − 1 V og kontinuerlig mater ut strømmen inn i cellen. Bruk det konfokalmikroskopi mikroskopet til å se på Cellefyllet. Øk den digitale zoomen for å se detaljene i cellen, og sørg for at spissen på elektroden er synlig inne i cellen.
Merk: Senk spenningen hvis det ser ut til at fargestoff lekker ut av cellen eller fyller andre celler i nærheten. Hvis det ser ut til at fargestoff fortsatt lekker ut av cellen, trekker du elektroden sakte ut og finner en annen celle. Det er viktig at fargestoffet ikke lekker å ha et høyt signal/bakgrunn ratio i det endelige bildet. - Vent i ca 15 min til finere grener og prosesser vises definert, slå av spenningen og forsiktig trekke elektrodespissen fra cellen.
- Identifiser astrocytter 40 − 50 μm under skive overflaten med infra-rød differensial forstyrrelser kontrast (IR-DIC). Se etter celler med langstrakt, oval somata ca 10 μm i diameter. Når en astrocytt er valgt, flytter du den til midten av synsfeltet.
- Bilde den fylte cellen.
Merk: bildebehandling kan utføres umiddelbart etterfylling eller etter farging med immunhistokjemi. En målsetting med en høyere numerisk blenderåpning (NA) resulterer i bedre oppløsning.- Vent til cellen går tilbake til opprinnelig form før bildebehandling (15 − 20 min) med 40x-objektiv. Hvis du vil avbilde cellen, justerer du innstillingen på konfokalmikroskopi for å sikre at de finere grenene og prosessene vises.
- Sett opp en z-stabel med en trinn størrelse på 0,3 μm. Mens bildebehandling, flytte målsettingen til det ikke er signal fra cellen og sett det som toppen. Deretter flytter målet ned (med fokus gjennom cellen) til det ikke er noe signal, sett det som bunnen.
- Etter at bildebehandling er fullført, sjekk elektroden for fargestoff utstøting. Hvis en stor fargestoff Sky vises, kan den brukes til neste sektor. Ellers erstatter du den med en ny elektrode.
Merk: Dye fylling av en enkelt astrocytt og bildebehandling tar ca 45 min til 1 t. For dette konkrete eksperimentet var det mulig å oppnå ca. 3 − 6 celler per mus. Hvis det er nødvendig, kan flere celler merkes på samme sektor. Men for å skille individuelle astrocytter, sørg for å holde en avstand på ca 200 μm mellom cellene.
6. farging med immunhistokjemi (valgfritt)
- En gang det tenkelig er gjort, med det samme sted det SKIVE inne 10% formalin opp på isen å gjemme for immunhistokjemi. Hold hjerne skiver i mørket og oppbevar over natten ved 4 ° c.
- Vask hjernen seksjoner 3x i 0,1 M PBS med 0,5% ioniske overflateaktivt middel (dvs. Triton X 100) i 5 minutter hver. Deretter ruge i en blokkering løsning av 0,1 M PBS med 0,5% ioniske overflateaktivt middel og 10% normal geit serum (NGS) for 1 t ved romtemperatur med skånsom agitasjon.
- Ruge avsnittene med agitasjon i primær antistoffer fortynnet i 0,1 M PBS med 0,5% ioniske overflateaktivt middel og 5% NGS for 2 dager ved 4 ° c.
Merk: På grunn av tykkelsen av hjerne skiver, må inkubasjonsperioden av de primære antistoffer utvides for bedre penetrasjon og antistoff konsentrasjonen kan økes. I dette eksperimentet ble en 1:500 fortynning brukt for anti GFAP antistoff og en 1:500 fortynning ble brukt til anti aquaporin-4 antistoff. - Vask seksjonene 3x i 0,1 M PBS med 0,5% ioniske overflateaktivt middel for 10 min hver og deretter ruge med sekundære antistoffer fortynnet i 0,1 M PBS med 0,5% ioniske overflateaktivt middel og 10% NGS i 6 timer ved romtemperatur.
Merk: Ikke Velg et sekundært antistoff opphisset av 488 NM, som er bølgelengden brukes til å visualisere LY fargestoff. I dette eksperimentet ble en 1:1000 fortynning brukt for Alexa fluor 546 Goat anti-Chicken IgG (H + L) og Alexa fluor 647 Goat anti-Rabbit IgG (H + L). - Skyll seksjonene 3x i 0,1 M PBS i 10 minutter hver. Deretter monteres delene på glass mikroskop lysbilder i monterings medier egnet for fluorescens. Seal lysbilder. Bilde celler med en trinn størrelse på 0,3 μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dataene som rapporteres i denne studien, er fra 7 − 12 celler fra 4 mus i hvert eksperiment. Gjennomsnittsdata rapporteres i figur panelene der det er hensiktsmessig.
For å vurdere astrocytt morfologi, utførte vi intracellulære Iontoforese bruker LY fargestoff for å fylle astrocytter i CA1 stratum radiatum, som er oppsummert i figur 1. Figur 2 viser en representativ astrocytt og dens forseggjorte morfologiske struktur. Cellen ble avbildet etter fiksering med 60x olje nedsenking linse på et konfokalmikroskopi laser-skanning mikroskop ved hjelp av 488 NM laser linje (trinn størrelse på 0,3 μm og 3,0 − 3.5 x digital zoom). Photomultiplier Tube (PMT), offset, og Gain funksjoner av konfokalmikroskopi mikroskop ble justert for å skape et høyt signal/bakgrunn ratio i det endelige bildet. I figur 2Avil bilder med ett optisk fly fra forskjellige z-trinn (vist hver 10 μm, merket i rekkefølge fra 1 − 6) avdekke sentrale Soma og flere store grener som deles inn i et tett nettverk av prosesser. Ved å generere en maksimal intensitet projeksjon (stabelstørrelse på 85 μm) observerte vi en detaljert visning av strukturen av astrocytt og dets domene (figur 2B). De viktigste komponentene i astrocytt struktur har også blitt notert. Figur 2 C viser en Zoom inn (X4) maksimal intensitet projeksjon av en stor gren, flere sekundære grener, og fordelingen av de omkringliggende branchlets og brosjyrer.
Morfologiske analyser og rekonstruksjoner av astrocytter ble utført med Imaris analyseprogramvare (tabell av materialer) ved hjelp av post-fiksering bilder av ly-fylt astrocytter (annenprogramvare som ImageJ kan også brukes). Etter gjenoppbyggingen av hver astrocytt ble fullført, volumene av Soma, store grener, prosesser og territorium ble kvantifisert. The Soma ble opprettet først med en overflate utjevning satt til x-y flyet oppløsning grense (0,25 μm). Den minste objekt diameter ble satt til 3,0 μm for å fjerne andre objekter som ikke er knyttet til celle kroppen. For å opprette de store grenene, var intensiteten av Soma maskert, på grunn av sin lysstyrke i forhold til resten av cellen. Overflaten utjevning og minimum objekt diameter av de store grenene ble satt til 0,3 μm (z Plane trinn størrelse). For å opprette prosessene, var intensiteten av de store grenene også maskert. Overflate utjevning ble satt til 0,18 μm og minimum objekt diameter ble satt til 0,3 μm. Territoriet til astrocytt ble opprettet ved hjelp av en lavere intensitet terskel og overflate utjevning satt til 0,75 μm. Figur 3a viser det opprinnelige bildet av en CA1 astrocytt. Cellen kropp, det større avdelinger, prosessene, og arealet kvantum omsluttet av det astrocytt er rekonstruert inne skikkelsen 3B-E. Etter rekonstruksjoner av cellene ble opprettet, volumene av Soma, hele cellen og territorium ble kvantifisert og antall store grener ble telt (tabell 1). CA1 astrocytter fra stratum radiatum hadde en gjennomsnittlig Soma volum på 488,91 μm3, gjennomsnitt av ~ 7 primær grener, gjennomsnittlig celle volum på 5,58 x 103 μm3, og gjennomsnittlig territorium volum på 2,94 x 104 μm3.
Den godt preget astrocytt markør, GFAP, er et cytoskjelettkomponenter protein som merker den mellomliggende filamenter av en astrocytt8. Etter astrocytter var fargestoff fylt, utførte vi immunostaining for GFAP å visualisere uttrykk i individuelle astrocytter (Figur 4). Vi fant ut at GFAP ble uttrykt i cellen Soma, store grener, og noen andre grener av astrocytter, men ikke i de finere grener og prosesser (Figur 4A). Det ble ikke funnet noen signifikant forskjell i antall primær grener merket av GFAP og de som ble angitt av LY (p = 0,1573; Figur 4 B). celleområdet og volumet av astrocytt merket med GFAP var signifikant mindre enn området og volumet som ble angitt med ly (p < 0,0001; Figur 4 C, D). Dette viser at GFAP er en pålitelig markør for merking av store grener, men er ikke nyttig for å bestemme den totale areal eller volum av cellen.
Et viktig trekk ved astrocytter er deres endfeet, som kontakt blodkar og foreslås å bidra til å regulere blodstrømmen i CNS. For ytterligere å forstå den romlige forholdet mellom astrocytter og hjernen blodkar, farget vi med antistoffer mot aquaporin-4 etter fargestoff fylling. Aquaporin-4 er et vannkanal protein funnet på astrocytter og ependymal celler, og er svært uttrykt i områder nær ventriklene og blodårene15. Vi fant at aquaporin-4 er uttrykt på astrocytt endfeet i umiddelbar nærhet til hjernen blodkar (figur 5A). Bildet viser tre astrocytt endfeet som kontakter en blodåre på forskjellige steder (indikert av de hvite pilene). I CA1 stratum radiatum, gjennomsnittlig antall endfeet per astrocytt var ~ 2 (figur 5B). Interessant, grenene som inneholder endfeet var betydelig tykkere enn de andre primær grenene av astrocytt, ved hjelp av den store grenen rekonstruksjoner (p = 0,0038; Figur 5 C). vi målte også lengden på grenene som inneholder endfeet fra sentrum av Soma til blodkaret og sammenlignet det med den korteste, direkte veien til blodkaret. Den faktiske lengden av grenene til blodkaret var betydelig større enn den korteste veien (p = 0,0333; Figur 5 D), som antyder at disse grenene har en tendens til å ta en lengre, circuitous rute til blodkaret. Film 1 skildrer en film av en rekonstruksjon av en ly-fylt astrocytt og aquaporin-4 farging. De ulike strukturelle komponentene i astrocytt (Soma, store grener, prosesser og territorium) er representert i tre dimensjoner. Den LY-fylte astrocytt sammen med aquaporin-4 farging skildrer astrocytt endfeet som omkranser blodkaret. Fra gjenoppbyggingen av de store grenene og blodkaret, grenene som inneholder endfeet kan bli visualisere strekker seg fra Soma til fartøyet.
I de foregående avsnittene, der p-verdier rapporteres, brukte vi en student t-test som ikke var sammenkoblet, med betydning på p < 0,05.
Figur 1: diagram over arbeidsflyt i ly-Iontoforese. Skjematisk representasjon av protokollen som fremhever de kritiske trinnene. Etter at musen var perfusert med bindemiddel, var hjernen dissekert. Etter en kort periode etter fiksering ble koronale seksjoner kuttet med en vibratome. Elektroden ble fylt med 1,5% LY fargestoff. Astrocytter ble identifisert i CA1 stratum radiatum ved hjelp av IR-DIC på et lett mikroskop. Den Soma av cellen ble Impaled av elektroden, og fargestoff ble injisert i cellen ved å bruke 0,5 − 1 V til de finere prosessene var helt fylt. Stykket ble avbildet med konfokalmikroskopi mikroskopi ved hjelp av en 40x vann nedsenking linse og deretter behandlet for immunhistokjemi. Videre Imaging ble gjennomført med en 60x olje nedsenking linse for å utføre celle gjenoppbygging og morfologiske analyse. Vist er et eksempel rekonstruksjon av prosessene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: ly-fylt astrocytt av CA1 stratum radiatum. (A) enkeltstående bilder med optisk plan fra en astrocytt vist hver 10 μm (merket 1 − 6). (B) maksimal projeksjon av astrocytt, som skildrer cellen Soma, flere store grener, og mange prosesser som utgjør sin buskete territorium. (C) maksimal projeksjon (Zoom X4) av en stor gren (fra avsnitt skissert i gult), to andre grener, flere branchets, og organiseringen av de omkringliggende prosessene. Scale bar = 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: rekonstruksjon av en ly-fylt astrocytt og dens komponenter. (A) CA1 astrocytt fylt med ly. (B-E) Tredimensjonal rekonstruksjon av Soma (B), Soma og store grener (C), prosesser (D) og territorium (E) ved 0 ° og 45 ° orientering. Scale bar = 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: GFAP immunostaining i ly-fylt astrocytter. (A) representativ z-projeksjon av ly (grønn) og GFAP (magenta) farging. GFAP uttrykkes primært i primær og noen sekundære grener av astrocytt, men ble ikke funnet i hele astrocytt territorium. Scale bar = 10 μm. (B) graf over antall primær grener merket av ly og GFAP. (C) celleområde BETEGNET av ly og GFAP farging. (D) celle volum merket med ly og GFAP farging. Åpne sirkler er rådata med lukkede firkanter indikerer gjennomsnittlig ± SEM. data ble samlet inn fra 12 celler fra 4 mus. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Aquaporin-4 immunostaining i ly-fylt astrocytter. (A) representativ z-projeksjon av ly (grønn) og aquaporin-4 farging (magenta). Aquaporin-4 uttrykkes hovedsakelig i endfeet av astrocytt. Hvite piler betegner de tre endfeet som de kontakter en nærliggende blod fartøy. Scale bar = 10 μm. (B) antall grener med endfeet per astrocytt. (C) tykkelse av grener med endfeet i forhold til de andre primære grener av astrocytter. (D) lengde på grener med endfeet i forhold til den korteste veien til blodkaret. Åpne sirkler er rådata med lukkede firkanter som indikerer gjennomsnittlig ± SEM. data ble samlet inn fra 7 celler fra 4 mus. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Film 1: rekonstruksjon av en ly-fylt astrocytt og aquaporin-4 farging. Representative film av en CA1 astrocytt i nærheten av et blod fartøy. The Soma, store grener, prosesser og territorium ble rekonstruert for å analysere morfologi av cellen. Gjenoppbyggingen av de store grenene sammen med aquaporin-4 skildrer to astrocytt endfeet direkte kontakt med blodkaret. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
| Morfologiske egenskaper | Gjennomsnittlig ± SEM |
| Soma volum (μm3) | 489 ± 30 |
| Antall primære grener | 7,0 ± 0,5 |
| Celle volum (μm3) | 5580 ± 425 |
| Territorium volum (μm3) | 29391 ± 8150 |
| Antall celler | 14 |
Tabell 1: morfologiske analyse av astrocytt struktur. Astrocytt Soma volum, antall primære grener per astrocytt, astrocytt celle volum, og volum omgitt av astrocytt territorium vises. Data ble samlet inn fra 14 celler fra 7 mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden skissert i denne utredningen beskriver en måte å visualisere astrocytt morfologi ved hjelp av intracellulære Iontoforese av LY fargestoff i lett faste hjerne skiver. Det er flere kritiske faktorer uthevet i denne protokollen som bidrar til vellykket LY Iontoforese og morfologiske rekonstruksjon av cellene. En faktor er kvaliteten og reproduserbarhet av bildene, som bestemmes i stor grad av alder av musen og utfallet av. I denne studien brukte vi C57/BL6N mus 6 − 8 uker gammel. En vellykket blod (sterkt avhengig av riktig plassering av perfusing nålen og bemerket av en hvit-farget hjerne og fravær av blodet i hjernen blodkar) er nødvendig for de mest detaljerte og tydelig fylte celler. Etter impalement av en elektrode, bør cellemembranen opprettholde en tett forsegling rundt spissen av elektroden og hindre fargestoff lekker ut. Til tross for beste innsats, vil noen ganger andre strukturer utenfor cellen bli fylt som pipette er avansert gjennom hjernevev: vi utelukket disse cellene fra analysen. Motstanden av elektrodene er en ekstra nøkkelfaktor. Den høye motstanden bare tillater en jevn utstøting av fargestoff fra elektroden spissen ved spenning stimulering. Mer teknisk, er det viktig å opprettholde milde, langsomme bevegelser når impaling av Soma av cellen med elektroden. Elektrode penetrasjon gjennom cellen kan føre til farge lekkasje fra Soma. En vellykket impalement etterfulgt av spennings søknad bør resultere i nesten umiddelbar fargestoff fylling av celle kroppen og prosesser (dvs. i løpet av få sekunder). Tiden som kreves for å fylle en astrocytt fullstendig er knyttet til territoriet den omfatter; men vent å sikre finere prosessene er helt fylt (minst 15 min).
Vi fant denne protokollen til å være en mest trofaste måte å studere astrocytt morfologi i detalj, likevel har metoden sine begrensninger. Å identifisere en celle kan være tidkrevende og utsatt for feil. Under IR-DIC, bør man identifisere karakteristiske trekk som markerer den spesifikke celle type (Soma form og størrelse). Alternativt, uttrykk for røde fluorescerende journalister spesielt i astrocytter, ved viral injeksjon eller en transgene mus reporter linje, gjør det mulig for enklere identifisering av disse cellene før fylling. Dessuten er LY begrenset som en cytosolic fargestoff fordi den ikke kan brukes til å merke astrocytt membranen, i forhold til merking med en membran-bundet GFP, slik som LCK-GFP16. LCK-GFP ville gi en mer nøyaktig representasjon av hele territoriet området, som LY Iontoforese avslører den interne volumet av en astrocytt. Men, avhengig av eksperimentell design, er LY Iontoforese bedre egnet til å løse hele astrocytt interne volum, utvikle tredimensjonale rekonstruksjoner, og kvantifisere de anatomiske komponentene som utgjør en astrocytt struktur6 . Til slutt, som med alle former for konfokalmikroskopi mikroskopi, er romlig oppløsning begrenset av Diffraksjon, bemerket som punkt spredningen funksjon av mikroskopet optikk17. Endre komponenter i bilde systemet, for eksempel redusere pinhole diameter, vil bidra til å forbedre bildene, men den sanne oppløsningen bestemmes av Bølgelengden av lys og den numeriske blenderåpningen på objektivlinsen. I vårt tilfelle anslår vi den beste oppløsningen mulig er trolig rundt 300 NM, som sannsynligvis vil bli verre i z-aksen.
LY-Iontoforese tilbyr flere fordeler fremfor andre vanlige metoder for å merke astrocytter. Protokollen kan brukes i enhver etablert musemodell, cellepopulasjon eller hjerne region18,19,20 ettersom den ikke er begrenset av en astrocytt spesifikk formidler eller en transgene Mouse-linje. Genetiske tilnærminger for å uttrykke fluorescerende proteiner som overalt i astrocytter av virale injeksjoner eller transgene mus reporter linjer (dvs. TD-tomat) krever bruk av en astrocytt promoter, som i enkelte regioner, kan uttrykkes i andre celletyper eller ikke inkluderer alle astrocytter21. LY-Iontoforese er også tidseffektiv, ettersom virale injeksjoner av fluorescerende proteiner krever kirurgi og tid til å uttrykke det spesifikke viruset, og transgene Mouse-linjer krever avl. Til slutt, ly Iontoforese er en nyttig metode for å skille individuelle celler, mens andre strategier vil også må kombineres med en metode for sparsom merking for å visualisere territoriene til individuelle astrocytter22,23, 24. Men ingen metode er et universalmiddel og valg av som brukes må skreddersys til det konkrete spørsmålet blir adressert.
Fremtidige studier kan ansette spesifikke eksperimentelle manipulasjoner og undersøke ulike komponenter av astrocytt struktur (Soma, grener, prosesser, territorium, etc.) for å svare morfologiske spørsmål. Dette kan gi innsikt og retning i astrocytt morfologi og dens funksjonelle implikasjoner, som kan analyseres ytterligere ved super oppløsning lys mikroskopi eller elektron mikroskopi4. For eksempel gir LY Iontoforese et middel til å visualisere fine astrocytt prosesser, som kontakter tusenvis av synapser og er involvert i Synaptic funksjoner. Studere hvordan strukturen i disse prosessene endringer i ulike patologiske tilstander kunne bidra til å belyse rollene til astrocytter i helse og sykdom. LY-Iontoforese er en viktig teknikk for å visualisere detaljert celle morfologi og karakterisere astrocytt egenskaper for bedre å forstå deres funksjoner i sentralnervesystemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker MS Soto, Dr. Yu, og Dr. Octeau for veiledning, samt kommentarer på teksten. Dette arbeidet er støttet av NS060677.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher | SF 100-20 | An identical alternative can be used |
| Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane | Pall | 4692 | An identical alternative can be used |
| Ag/AgCl ground pellet | WPI | EP2 | A similar alternative can be used |
| Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L) | Thermo Scientific | A-11040 | A similar alternative can be used |
| Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Scientific | A27040 | A similar alternative can be used |
| Anti Aquaporin-4 antibody | Novus Biologicals | NBP1-87679 | A similar alternative can be used |
| Anti GFAP antibody | Abcam | ab4674 | A similar alternative can be used |
| Borosilicate glass pipettes with filament | World precision instruments | 1B150F-4 | |
| C57BL/6NTac mice | Taconic Stock | B6 | A similar alternative can be used |
| Calcium Chloride | Sigma | 21108 | An identical alternative can be used |
| Confocal laser-scanning microscope | Olympus | FV1000MPE | A similar alternative can be used |
| D-glucose | Sigma | G7528 | An identical alternative can be used |
| Disodium Phosphate | Sigma | 255793 | An identical alternative can be used |
| Electrode puller- Model P-97 | Sutter | P-97 | A similar alternative can be used |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | An identical alternative can be used |
| Heparin sodium injection (1,000 USP per mL) | Sagent Pharmaceuticals | 400-10 | An identical alternative can be used |
| Imaris software (Version 7.6.5) | Bitplane Inc. | A similar alternative can be used | |
| Isofluorane | Henry Schein Animal Health | 29404 | An identical alternative can be used |
| Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%) | Clipper | 1050035 | An identical alternative can be used |
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma | L0259 | |
| Lucifer Yellow CH dipotassium salt | Sigma | L0144 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | An identical alternative can be used |
| Microscope Cover Glass | Thermo Scientific | 24X60-1 | An identical alternative can be used |
| Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | An identical alternative can be used |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | An identical alternative can be used |
| Objective lens (40x) | Olympus | LUMPLFLN 40XW | A similar alternative can be used |
| Objective lens (60x) | Olympus | PlanAPO 60X | A similar alternative can be used |
| PBS tablets, 100 mL | VWR | VWRVE404 | An identical alternative can be used |
| Pipette micromanipulator- Model ROE-200 | Sutter | MP-285 / ROE-200 / MPC-200 | A similar alternative can be used |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911 | An identical alternative can be used |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | An identical alternative can be used |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | An identical alternative can be used |
| Stimulator- Model Omnical 2010 | World precision instruments | Omnical 2010 | A similar alternative can be used |
| Triton X 100 | Sigma | T8787 | An identical alternative can be used |
| Vibratome- Model #3000 | Pelco | 100-S | A similar alternative can be used |
References
- Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits. Nature Neuroscience. 18 (7), 942-952 (2015).
- Ben Haim, L., Rowitch, D. H. Functional diversity of astrocytes in neural circuit regulation. Nature Reviews Neuroscience. 18 (1), 31-41 (2017).
- Schiweck, J., Eickholt, B. J., Murk, K. Important Shapeshifter: Mechanisms Allowing Astrocytes to Respond to the Changing Nervous System During Development, Injury and Disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 261 (2018).
- Chai, H., et al. Neural Circuit-Specialized Astrocytes: Transcriptomic, Proteomic, Morphological, and Functional Evidence. Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).
- Sun, D., Jakobs, T. C. Structural remodeling of astrocytes in the injured CNS. Neuroscientist. 18 (6), 567-588 (2012).
- Naskar, S., Chattarji, S. Stress Elicits Contrasting Effects on the Structure and Number of Astrocytes in the Amygdala versus Hippocampus. eNeuro. 6 (1), (2019).
- Sun, D., Lye-Barthel, M., Masland, R. H., Jakobs, T. C. The morphology and spatial arrangement of astrocytes in the optic nerve head of the mouse. Journal of Comparative Neurology. 516 (1), 1-19 (2009).
- Grosche, A., et al. Versatile and simple approach to determine astrocyte territories in mouse neocortex and hippocampus. PLoS ONE. 8 (7), 69143 (2013).
- Kaynig, V., et al. Large-scale automatic reconstruction of neuronal processes from electron microscopy images. Medical Image Analysis. 22 (1), 77-88 (2015).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
- Wilhelmsson, U., et al. Redefining the concept of reactive astrocytes as cells that remain within their unique domains upon reaction to injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17513-17518 (2006).
- Williams, M. E., et al. Cadherin-9 regulates synapse-specific differentiation in the developing hippocampus. Neuron. 71 (4), 640-655 (2011).
- Ogata, K., Kosaka, T. Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus. Neuroscience. 113 (1), 221-233 (2002).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Hubbard, J. A., Hsu, M. S., Seldin, M. M., Binder, D. K. Expression of the Astrocyte Water Channel Aquaporin-4 in the Mouse Brain. ASN Neuro. 7 (5), (2015).
- Benediktsson, A. M., et al. Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures. Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 41-53 (2005).
- Fouquet, C., et al. Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media. PLoS ONE. 10 (3), 0121096 (2015).
- Luna, G., et al. Astrocyte structural reactivity and plasticity in models of retinal detachment. Experimental Eye Research. 150, 4-21 (2016).
- Octeau, J. C., et al. An Optical Neuron-Astrocyte Proximity Assay at Synaptic Distance Scales. Neuron. 98 (1), 49-66 (2018).
- Sosunov, A. A., et al. Phenotypic heterogeneity and plasticity of isocortical and hippocampal astrocytes in the human brain. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2285-2298 (2014).
- Park, Y. M., et al. Astrocyte Specificity and Coverage of hGFAP-CreERT2 [Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc] Mouse Line in Various Brain Regions. Experimental Neurobiology. 27 (6), 508-525 (2018).
- Koeppen, J., et al. Functional Consequences of Synapse Remodeling Following Astrocyte-Specific Regulation of Ephrin-B1 in the Adult Hippocampus. Journal of Neuroscience. 38 (25), 5710-5726 (2018).
- Jefferis, G. S., Livet, J. Sparse and combinatorial neuron labelling. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 101-110 (2012).
- Lanjakornsiripan, D., et al. Layer-specific morphological and molecular differences in neocortical astrocytes and their dependence on neuronal layers. Nature Communications. 9 (1), 1623 (2018).
