Summary

Визуализация морфологии астроцитов с использованием люцифера желтого ионтофореза

Published: September 14, 2019
doi:

Summary

Астроциты являются морфологически сложными клетками, о чем свидетельствует их многочисленные процессы и густые территории. Для анализа их сложной морфологии мы представляем надежный протокол для выполнения внутриклеточного люцифера желтого ионтофореза в слегка фиксированной ткани.

Abstract

Астроциты являются важнейшими компонентами нейронных цепей. Они плитки всей центральной нервной системы (ЦНС) и участвуют в различных функций, которые включают нейромедиатор зазор, ионная регуляция, синаптической модуляции, метаболической поддержки нейронов, и регулирование кровотока. Астроциты являются сложными клетками, которые имеют сома, несколько крупных ветвей, и многочисленные тонкие процессы, которые контактируют с различными клеточными элементами в нейропиле. Для того, чтобы оценить морфологию астроцитов, необходимо иметь надежный и воспроизводимый метод визуализации их структуры. Мы сообщаем о надежном протоколе для выполнения внутриклеточного ионтофореза астроцитов с использованием флуоресцентного желтого (LY) красителя Люцифера в слегка фиксированной ткани мозга от взрослых мышей. Этот метод имеет несколько особенностей, которые полезны для характеристики морфологии астроцитов. Это позволяет трехмерную реконструкцию отдельных астроцитов, что полезно для проведения морфологического анализа по различным аспектам их структуры. Иммуногистохимия вместе с ионтофорусом LY также может быть использована для понимания взаимодействия астроцитов с различными компонентами нервной системы и для оценки экспрессии белков в обозначенных астроцитах. Этот протокол может быть реализован в различных моделях мыши расстройств ЦНС для тщательного изучения морфологии астроцитов с помощью световой микроскопии. Ионтофорез LY обеспечивает экспериментальный подход к оценке структуры астроцитов, особенно в контексте травмы или болезни, где эти клетки предлагается претерпеть значительные морфологические изменения.

Introduction

Астроциты являются наиболее распространенными глиальными клетками в центральной нервной системе (ЦНС). Они играют роль в ионного гомеостаза, регуляции кровотока, формирования синапсов, а также ликвидации, и поглощение нейромедиатора1. Широкий спектр функций астроцитов отражается в их сложной морфологической структуре2,3. Астроциты содержат несколько первичных и вторичных ветвей, которые делятся на тысячи тонких ветвей и листовок, которые непосредственно взаимодействуют с синапсами, дендритами, аксонами, кровеносными сосудами и другими глиальными клетками. Морфология астроцитов варьируется в разных областях мозга, что может намекать на их способность выполнять свои функции дифференцированным в нейронных цепях4. Кроме того, астроциты, как известно, изменить свою морфологию во время развития, во время физиологических условий, и в нескольких состояниях болезни3,5,6.

Для точного решения сложности морфологии астроцитов необходим последовательный, воспроизводимый метод. Традиционно, иммуногистохимия была использована для визуализации астроцитов с использованием астроцитов конкретных или астроцитов обогащенных маркеров белка. Тем не менее, эти методы показывают структуру экспрессии белка, а не структуру астроцитов. Широко используемые маркеры, такие как глиальный фибриллюкислый кислотный белок (GFAP) и S100 кальций связывающий белок (S100), не выражаются во всем объеме клеток и, таким образом, не разрешают полную морфологию7. Генетические подходы к экспрессу флуоресцентных белков повсеместно в астроцитах (вирусные инъекции или трансгенные линии репортера мыши) могут определить более тонкие ветви и общую территорию. Тем не менее, трудно дифференцировать отдельные астроциты, и анализы могут быть предвзятыми по популяции астроцитов, мишенью для конкретногопромоутера 8. Для выявления детальной картины взаимодействия астроцитных процессов с синапсами используется серийная электронная микроскопия. Из-за тысяч астроцитов процессов контакта синапсов, в настоящее время не представляется возможным реконструировать всю ячейку с этой техникой9, хотя это, как ожидается, изменится с использованием машинного обучения подходов для анализа данных.

В этом отчете мы сосредоточиваемся на процедуре характеристики астроцитов мыши с использованием внутриклеточного ионтофорасиса с желтым (LY) красителем Люцифера, используя радиат слоя CA1 в качестве примера. Метод основан на новаторской прошлой работе Эрикbus и Марк Эллисман10,11. Астроциты из слегка фиксированных ломтиков мозга идентифицируются по их отличительной форме сомы и заполнены LY. Клетки затем изображены с конфокальной микроскопией. Мы демонстрируем, как ионтофорес LY может быть использован для реконструкции отдельных астроцитов и проведения детального морфологического анализа их процессов и территории. Кроме того, этот метод может быть применен в сочетании с иммуногистохимии для выявления пространственных связей и взаимодействий между астроцитами и нейронами, другими глиальными клетками и сосудами мозга. Мы считаем, LY ионтофорез, чтобы быть очень подходящим инструментом для анализа морфологии в различных областях мозга и мыши модели здоровых или заболеваний условия7,12,13.

Protocol

Эксперименты на животных в этом исследовании были проведены в соответствии с Национальным институтом здравоохранения Руководство по уходу и использованию лабораторных животных и были одобрены Комитетом по исследованиям животных канцлера в Университете Калифорнии, Лос-Анджелес. Взр…

Representative Results

Данные, представленные в этом исследовании, от 7 до 12 клеток от 4 мышей в каждом эксперименте. Средние данные регистрируются в группах цифр, где это уместно. Для оценки морфологии астроцитов мы провели внутриклеточный ионтофорус с помощью LY красителя для заполнения астроц…

Discussion

Метод, изложенный в настоящей статье, описывает способ визуализации морфологии астроцитов с помощью внутриклеточного ионтофореза ЛАЙ-красителя в слегка фиксированных ломтиках мозга. Есть несколько критических факторов, отмеченных в этом протоколе, которые способствуют успешной ион?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы благодарят г-жу Сото, д-ра Yu и д-ра Октко за рекомендации, а также за комментарии к тексту. Эта работа поддерживается NS060677.

Materials

10% Buffered Formalin Phosphate Fisher SF 100-20 An identical alternative can be used
Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane Pall 4692 An identical alternative can be used
Ag/AgCl ground pellet WPI EP2 A similar alternative can be used
Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L) Thermo Scientific A-11040 A similar alternative can be used
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) Thermo Scientific A27040 A similar alternative can be used
Anti Aquaporin-4 antibody Novus Biologicals NBP1-87679 A similar alternative can be used
Anti GFAP antibody Abcam ab4674 A similar alternative can be used
Borosilicate glass pipettes with filament World precision instruments 1B150F-4
C57BL/6NTac mice Taconic Stock B6 A similar alternative can be used
Calcium Chloride Sigma 21108 An identical alternative can be used
Confocal laser-scanning microscope Olympus FV1000MPE A similar alternative can be used
D-glucose Sigma G7528 An identical alternative can be used
Disodium Phosphate Sigma 255793 An identical alternative can be used
Electrode puller- Model P-97 Sutter P-97 A similar alternative can be used
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01 An identical alternative can be used
Heparin sodium injection (1,000 USP per mL) Sagent Pharmaceuticals 400-10 An identical alternative can be used
Imaris software (Version 7.6.5) Bitplane Inc. A similar alternative can be used
Isofluorane Henry Schein Animal Health 29404 An identical alternative can be used
Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%) Clipper 1050035 An identical alternative can be used
Lucifer Yellow CH dilithium salt Sigma L0259
Lucifer Yellow CH dipotassium salt Sigma L0144
Magnesium Chloride Sigma M8266 An identical alternative can be used
Microscope Cover Glass Thermo Scientific 24X60-1 An identical alternative can be used
Microscope Slides Fisher 12-544-2 An identical alternative can be used
Normal Goat Serum Vector Laboratories S-1000 An identical alternative can be used
Objective lens (40x) Olympus LUMPLFLN 40XW A similar alternative can be used
Objective lens (60x) Olympus PlanAPO 60X A similar alternative can be used
PBS tablets, 100 mL VWR VWRVE404 An identical alternative can be used
Pipette micromanipulator- Model ROE-200 Sutter MP-285 / ROE-200 / MPC-200 A similar alternative can be used
Potassium Chloride Sigma P3911 An identical alternative can be used
Sodium Bicarbonate Sigma S5761 An identical alternative can be used
Sodium Chloride Sigma S5886 An identical alternative can be used
Stimulator- Model Omnical 2010 World precision instruments Omnical 2010 A similar alternative can be used
Triton X 100 Sigma T8787 An identical alternative can be used
Vibratome- Model #3000 Pelco 100-S A similar alternative can be used

References

  1. Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits. Nature Neuroscience. 18 (7), 942-952 (2015).
  2. Ben Haim, L., Rowitch, D. H. Functional diversity of astrocytes in neural circuit regulation. Nature Reviews Neuroscience. 18 (1), 31-41 (2017).
  3. Schiweck, J., Eickholt, B. J., Murk, K. Important Shapeshifter: Mechanisms Allowing Astrocytes to Respond to the Changing Nervous System During Development, Injury and Disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 261 (2018).
  4. Chai, H., et al. Neural Circuit-Specialized Astrocytes: Transcriptomic, Proteomic, Morphological, and Functional Evidence. Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).
  5. Sun, D., Jakobs, T. C. Structural remodeling of astrocytes in the injured CNS. Neuroscientist. 18 (6), 567-588 (2012).
  6. Naskar, S., Chattarji, S. Stress Elicits Contrasting Effects on the Structure and Number of Astrocytes in the Amygdala versus Hippocampus. eNeuro. 6 (1), (2019).
  7. Sun, D., Lye-Barthel, M., Masland, R. H., Jakobs, T. C. The morphology and spatial arrangement of astrocytes in the optic nerve head of the mouse. Journal of Comparative Neurology. 516 (1), 1-19 (2009).
  8. Grosche, A., et al. Versatile and simple approach to determine astrocyte territories in mouse neocortex and hippocampus. PLoS ONE. 8 (7), 69143 (2013).
  9. Kaynig, V., et al. Large-scale automatic reconstruction of neuronal processes from electron microscopy images. Medical Image Analysis. 22 (1), 77-88 (2015).
  10. Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
  11. Wilhelmsson, U., et al. Redefining the concept of reactive astrocytes as cells that remain within their unique domains upon reaction to injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17513-17518 (2006).
  12. Williams, M. E., et al. Cadherin-9 regulates synapse-specific differentiation in the developing hippocampus. Neuron. 71 (4), 640-655 (2011).
  13. Ogata, K., Kosaka, T. Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus. Neuroscience. 113 (1), 221-233 (2002).
  14. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  15. Hubbard, J. A., Hsu, M. S., Seldin, M. M., Binder, D. K. Expression of the Astrocyte Water Channel Aquaporin-4 in the Mouse Brain. ASN Neuro. 7 (5), (2015).
  16. Benediktsson, A. M., et al. Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures. Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 41-53 (2005).
  17. Fouquet, C., et al. Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media. PLoS ONE. 10 (3), 0121096 (2015).
  18. Luna, G., et al. Astrocyte structural reactivity and plasticity in models of retinal detachment. Experimental Eye Research. 150, 4-21 (2016).
  19. Octeau, J. C., et al. An Optical Neuron-Astrocyte Proximity Assay at Synaptic Distance Scales. Neuron. 98 (1), 49-66 (2018).
  20. Sosunov, A. A., et al. Phenotypic heterogeneity and plasticity of isocortical and hippocampal astrocytes in the human brain. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2285-2298 (2014).
  21. Park, Y. M., et al. Astrocyte Specificity and Coverage of hGFAP-CreERT2 [Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc] Mouse Line in Various Brain Regions. Experimental Neurobiology. 27 (6), 508-525 (2018).
  22. Koeppen, J., et al. Functional Consequences of Synapse Remodeling Following Astrocyte-Specific Regulation of Ephrin-B1 in the Adult Hippocampus. Journal of Neuroscience. 38 (25), 5710-5726 (2018).
  23. Jefferis, G. S., Livet, J. Sparse and combinatorial neuron labelling. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 101-110 (2012).
  24. Lanjakornsiripan, D., et al. Layer-specific morphological and molecular differences in neocortical astrocytes and their dependence on neuronal layers. Nature Communications. 9 (1), 1623 (2018).

Play Video

Cite This Article
Moye, S. L., Diaz-Castro, B., Gangwani, M. R., Khakh, B. S. Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis. J. Vis. Exp. (151), e60225, doi:10.3791/60225 (2019).

View Video