루시퍼 황색 이온토포레시스를 사용하여 성상세포 형태 시각화
Summary
성상 세포는 형태학적으로 복잡한 세포이며, 여러 과정과 덤불 영토에 의해 예시됩니다. 그들의 정교한 형태를 분석하기 위하여는, 우리는 가볍게 고정한 조직에서 세포내 Lucifer 황색 이온 포레시스를 능력을 발휘하기 위하여 믿을 수 있는 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
성상 세포는 신경 회로의 필수 구성 요소입니다. 그(것)들은 전체 중추 신경계 (CNS)를 타일하고 신경 전달 물질 정리, 이온 규칙, 시냅스 변조, 뉴런에 대한 신진 대사 지원 및 혈류 조절을 포함하는 다양한 기능에 관여합니다. 성상 세포는 소마, 여러 가지, 그리고 neuropil 내의 다양한 세포 요소에 접촉하는 수많은 미세 한 과정이 복잡한 세포입니다. 성상 세포의 형태를 평가하기 위해서는 구조를 시각화하는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 방법이 필요합니다. 우리는 성인 마우스에서 가볍게 고정 된 뇌 조직에서 형광 루시퍼 노란색 (LY) 염료를 사용하여 성상 세포의 세포 내 이온 토포레스를 수행하는 신뢰할 수있는 프로토콜을보고합니다. 이 방법에는 성상 세포 형태를 특성화하는 데 유용한 몇 가지 기능이 있습니다. 그것은 개별 성상 세포의 3 차원 재건을 허용, 이는 구조의 다른 측면에 형태 학적 분석을 수행하는 데 유용합니다. LY 이온 토포레시스와 함께 면역 조직 화학은 또한 신경계의 다른 구성 요소와 성상 세포의 상호 작용을 이해하고 표지 된 성상 세포 내에서 단백질의 발현을 평가하기 위해 이용될 수 있습니다. 이 프로토콜은 경검사법으로 성상세포 형태를 엄격하게 검사하기 위해 CNS 장애의 다양한 마우스 모델에서 구현될 수 있다. LY 이온 토포레시스는 성상 세포 구조를 평가하기 위한 실험적 접근법을 제공하며, 특히 이러한 세포가 중요한 형태학적 변화를 겪도록 제안된 부상이나 질병의 맥락에서.
Introduction
성상 세포는 중추 신경계에서 가장 풍부한 신경교 세포입니다 (CNS). 그들은 이온 항상성, 혈류 조절, 시냅스 형성뿐만 아니라 제거 및 신경 전달 물질 섭취 량1. 성상 세포 함수의 넓은 범위는 복잡한 형태 구조2,3에반영됩니다. 성상 세포는 시냅스, 모수석, 축사, 혈관 및 기타 신경교 세포와 직접 상호 작용하는 수천 개의 미세한 가지와 전단지로 나누는 여러 가지 기본 및 이차 가지를 포함합니다. 성상 세포 형태는 신경 회로4에서 그들의 기능을 차별적으로 수행하는 그들의 기능에 암시할 수 있는 다른 두뇌 지구에 걸쳐변화합니다. 더욱이, 성상 세포는 발달 도중, 생리적인 조건 도중, 및 다중 질병 상태3,5,6에서그들의 형태를 바꾸기 위하여 알려지고 있습니다.
성상 세포 형태학의 복잡성을 정확하게 해결하기 위해서는 일관되고 재현 가능한 방법이 필요합니다. 전통적으로, 면역히스토화학은 성상세포 특이적 또는 성상세포 농축 단백질 마커를 사용하여 성상세포를 시각화하는 데 사용되어 왔다. 그러나, 이러한 방법은 성상 세포의 구조보다는 단백질 발현의 패턴을 드러낸다. 신경교 섬유산성 단백질(GFAP) 및 S100 칼슘 결합 단백질 β(S100β)와 같은 일반적으로 사용되는 마커는 전체 세포 부피에서 발현되지 않으며 따라서 완전한 형태론7을해결하지 못한다. 성상 세포 (바이러스 주사 또는 형질 전환 마우스 기자 라인)에서 유비쿼터스형형 단백질을 발현하는 유전 적 접근법은 미세한 가지 및 전체 영역을 식별 할 수 있습니다. 그러나, 개별 성상세포를 구별하기 어렵고, 분석은 특정 프로모터8에의해 표적화된 성상세포 집단에 의해 편향될 수 있다. 직렬 섹션 전자 현미경 검사법은 시냅스와 성상 세포 프로세스의 상호 작용의 상세한 그림을 밝히기 위하여 이용되었습니다. 시냅스와 접촉하는 수천 개의 성상 세포 프로세스로 인해 현재이 기술9로전체 세포를 재구성 할 수는 없지만 데이터 분석을위한 기계 학습 접근 법을 사용하여 변경 될 것으로 예상됩니다.
이 보고서에서는 CA1 지층 라디덤을 예로 사용하여 루시퍼 옐로우(LY) 염료로 세포내 이온포레시스를 사용하여 마우스 성상세포를 특성화하는 절차에 중점을 둡니다. 이 방법은 에릭 부송과 마크 엘리스만10,11의선구적인 과거 작품을 기반으로합니다. 가볍게 고정 된 뇌 조각에서 성상 세포는 그들의 독특한 소마 모양에 의해 확인 되 고 LY로 가득. 세포는 공초점 현미경 검사법으로 그 때 심상됩니다. 우리는 LY 이온 토포레시스가 개별 성상 세포들을 재구성하고 그들의 프로세스 및 영토의 상세한 형태학적 분석을 수행하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다. 또한,이 방법은 성상 세포와 뉴런, 다른 신경교 세포, 뇌 혈관 사이의 공간 관계와 상호 작용을 식별하기 위해 면역 조직 화학과 함께 적용 할 수 있습니다. 우리는 LY 이온 토포레시스가 건강 또는 질병 상태의 다른 뇌 영역 및 마우스 모델에서 형태를 분석하는 매우 적합한 도구라고 생각7,12,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 백서에 설명된 방법은 가볍게 고정된 두뇌 조각에 있는 LY 염료의 세포내 이온 백공증을 사용하여 성상 세포 형태를 구상하는 쪽을 기술합니다. 세포의 성공적인 LY 이온 토포레시스 및 형태학적 재건에 기여하는 이 프로토콜에서 강조된 몇몇 중요한 요인이 있습니다. 한 가지 요인은 이미지의 품질과 재현성이며, 이는 주로 마우스의 나이와 관류의 결과에 의해 결정됩니다. 이 연구에서는, 우?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 소토 씨, 유 박사, 옥토 박사에게 지도와 텍스트에 대한 의견에 감사드립니다. 이 작업은 NS060677에서 지원됩니다.
Materials
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher | SF 100-20 | An identical alternative can be used |
| Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane | Pall | 4692 | An identical alternative can be used |
| Ag/AgCl ground pellet | WPI | EP2 | A similar alternative can be used |
| Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L) | Thermo Scientific | A-11040 | A similar alternative can be used |
| Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Scientific | A27040 | A similar alternative can be used |
| Anti Aquaporin-4 antibody | Novus Biologicals | NBP1-87679 | A similar alternative can be used |
| Anti GFAP antibody | Abcam | ab4674 | A similar alternative can be used |
| Borosilicate glass pipettes with filament | World precision instruments | 1B150F-4 | |
| C57BL/6NTac mice | Taconic Stock | B6 | A similar alternative can be used |
| Calcium Chloride | Sigma | 21108 | An identical alternative can be used |
| Confocal laser-scanning microscope | Olympus | FV1000MPE | A similar alternative can be used |
| D-glucose | Sigma | G7528 | An identical alternative can be used |
| Disodium Phosphate | Sigma | 255793 | An identical alternative can be used |
| Electrode puller- Model P-97 | Sutter | P-97 | A similar alternative can be used |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | An identical alternative can be used |
| Heparin sodium injection (1,000 USP per mL) | Sagent Pharmaceuticals | 400-10 | An identical alternative can be used |
| Imaris software (Version 7.6.5) | Bitplane Inc. | A similar alternative can be used | |
| Isofluorane | Henry Schein Animal Health | 29404 | An identical alternative can be used |
| Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%) | Clipper | 1050035 | An identical alternative can be used |
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma | L0259 | |
| Lucifer Yellow CH dipotassium salt | Sigma | L0144 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | An identical alternative can be used |
| Microscope Cover Glass | Thermo Scientific | 24X60-1 | An identical alternative can be used |
| Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | An identical alternative can be used |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | An identical alternative can be used |
| Objective lens (40x) | Olympus | LUMPLFLN 40XW | A similar alternative can be used |
| Objective lens (60x) | Olympus | PlanAPO 60X | A similar alternative can be used |
| PBS tablets, 100 mL | VWR | VWRVE404 | An identical alternative can be used |
| Pipette micromanipulator- Model ROE-200 | Sutter | MP-285 / ROE-200 / MPC-200 | A similar alternative can be used |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911 | An identical alternative can be used |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | An identical alternative can be used |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | An identical alternative can be used |
| Stimulator- Model Omnical 2010 | World precision instruments | Omnical 2010 | A similar alternative can be used |
| Triton X 100 | Sigma | T8787 | An identical alternative can be used |
| Vibratome- Model #3000 | Pelco | 100-S | A similar alternative can be used |
References
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