水動紡錘摂動後のメタフェイズタイミングと細胞運命のダイナミクスを評価するライブ細胞イメージング
Summary
ここでは、スピンドル形成と人工的進行のダイナミクスを評価するプロトコルを提示する。当社のタイムラプスイメージングの応用により、ユーザーは、人芽細胞の様々な段階で細胞を同定し、人芽細胞の欠陥を追跡および同定し、抗マイト薬への曝露時にスピンドルダイナミクスと人工細胞の運命を分析することができます。
Abstract
ライブセルタイムラプスイメージングは、固定細胞分析によって見落とされたり、誤解されたり、誤解されたりする細胞プロセスに関する洞察を提供する細胞生物学における重要なツールです。固定細胞イメージングと解析は堅牢で、細胞の定常状態を観察するのに十分ですが、細胞レベルでイベントの時間的順序を定義する際に制限され、動的プロセスの一時的な性質を評価する能力が不十分です。水和性の進行。対照的に、ライブセルイメージングは、時間の経過とともに単一細胞レベルで細胞プロセスを観察するために使用できる雄弁なツールであり、固定細胞イメージングでは不十分に表現されるプロセスのダイナミクスをキャプチャする能力を有する。ここでは、クロマチンと微小管の蛍光標識マーカーを運ぶ細胞を生成するアプローチと、メタフェイズ染色体の整列と有形出口を監視するライブ細胞イメージングアプローチでの使用について説明する。人工的な様々な段階での細胞の同定、ミトシス欠陥の同定と追跡、紡錘のダイナミクスの解析など、スピンドル形成と人力の進行のダイナミクスを評価するイメージングベースの技術を説明し、人芽細胞の運命は、人工阻害剤による治療に続く。
Introduction
固定細胞の画像ベースの分析は、一般的に様々な摂動に応じて細胞集団レベルの変化を評価するために使用されます。細胞同期と組み合わせると、シリアルタイムポイントの収集とイメージングが続き、このようなアプローチを使用して、細胞配列のイベントを示唆することができます。それにもかかわらず、固定細胞イメージングは、時間的関係が集団に対して暗示され、個々の細胞のレベルで実証されないという限られたものである。このように、固定細胞イメージングと解析は、堅牢な型と定常状態の変化を観察するのに十分ですが、時間の経過に伴う一時的な変化や細胞の亜集団のみに影響を与える変化を検出する能力は不完全です。対照的に、ライブ細胞イメージングは、単一の細胞内の細胞および細胞集団内の細胞および細胞内のプロセスを、時間の経過とともに、それ自体が細胞行動に影響を与える可能性のある同期アプローチの助けを借りずに観察するために使用できる雄弁なツールです。1,2,3,4,5,6.
双極性人型のスピンドルの形成は、細胞分裂中の適切な染色体分離に不可欠であり、その結果、2つの遺伝的に同一の娘細胞が生じる。有人性スピンドル構造の欠陥は、有人性の進行を破壊し、染色体分離の忠実性を損なう可能性があり、壊滅的な細胞分裂と細胞生存率の低下をもたらす可能性があります。このため、スピンドル形成を変化させる有人毒は、癌細胞7、8、9の急速な増殖を制限する有望な治療法である。それにもかかわらず、有毒毒の添加後の紡錘構造の固定細胞分析は、スピンドル形成の動的過程を評価する能力に限られており、スピンドル構造の観察された変化が永続的であるか、またはあるかを示さないかもしれない代わりに一時的であり、成功した細胞分裂を可能にするために克服することができる。
このプロトコルでは、生細胞イメージングによるスピンドル摂動後のミトシスのダイナミクスを評価するアプローチについて述べた。RFPタグ付きヒストン2Bを発現するように設計されたhTERT不死化RPE-1細胞株を使用してクロマチンを可視化し、EGFPタグ付きαチューブリンと共に微小管、メタフェーズ染色体アライメントのタイミング、アナセ相発症、そして最終的には人体細胞の運命は、染色体の動き、圧縮、および核形態の視覚的手がかりを使用して評価される。
Protocol
1. RFP-ヒストン2B(RFP-H2B)およびα-チューブリン-EGFP(浴槽-EGFP)を安定して発現するhTERT-RPE-1細胞の生成 注:すべてのステップは無菌技術に従い、バイオセーフティレベルII+(BSL2+)安全キャビネットで行われます。 脂質ベースのトランスフェクション送達システムのメーカーの指示に従って、適切なレンチウイルスプラスミドを有する293T細胞のトランスフェクションによ?…
Representative Results
紡錘摂動の存在下での水疱性進行の評価スピンドル極集の調節は、適切な双極スピンドル形成に不可欠なステップです。タンパク質枯渇、薬物阻害、またはセントロソーム数の変化を介したこのプロセスにおける破壊は、紡錘構造を破壊し、有人進行を遅延または停止させる10、11、12、13。<sup class="x…
Discussion
タイムラプスイメージングによって提供される時間分解能は単一細胞内の連続した細胞事象の視覚化および評価を可能にする。細胞同期を利用したアプローチは、連続した時点での細胞の収集と固定に続くアプローチは、最終的に細胞の集団間で比較が行われるために制限される。摂動に対する細胞応答が不均一であるか、または視覚化されるプロセスが動的である状況では、生細胞のタイ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DLM は NSF GRFP によってサポートされます。ALMは、生物医学研究の卓越性のためのスミス家族賞からの資金によってサポートされています。
Materials
| 0.05% Trypsin | Gibo-Life sciences | 25-510 | A serine protease used to release adherent cells from culture dishes |
| 15ml centrifuge tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| 20x CFI Plan Fluor objective | Nikon | For use in Live-cell imaging to visualize both bright field and fluorescence | |
| 293T Cells | ATCC | CRL-3216 | For use in retroviral transfection; used in step 1.1 |
| a-tubulin-EGFP | Addgene | various numbers | Expression vector for alpha tubulin fused to a green fluorescent protein tag; for use in the visualization of tubulin in live-cell imaging: commercially available through addgene and other vendors |
| Alisertib | Selleckchem | S1133 | Small molecule inhibitor of the mitotic kinase Aurora A. Stock concentration is prepared at 10mM in DMSO, and used at a final concentration of 100nM. |
| Blasticidin | Invitrogen | A11139-03 | Antibiotic selection agent; used to select for a-tub-EGFP expressing cells |
| C02 | Airgas | For use in cell culture and live cell imaging | |
| Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3) | Chroma | 49005 | Single band filter set; excitation wavelength 545nm with 25nm bandwidth and emission at 605nm wavelength with 70nm bandwidth; for visualization of H2B-RFP |
| Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2) | Chroma | 49002 | Single band filter set; excitation wavelength 470nm with 40nm bandwidth and emission at 525nm wavelength with 50nm bandwidth; for visualization of GFP-tubulin |
| disposable glass Pastuer pipets, sterilized | Fisher Scientific | 13-678-6A | For use in aspirating cells |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibo-Life sciences | 11965-084 | Cell culture medium for growth of RPE-1 and 293T cells |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibo-Life sciences | 10438-026 | Cell culture medium supplement |
| Lipofectamine 3000 and p3000 | Invitrogen | L3000-015 | Lipid based transfection reagent for transfection of plasmids; used in 1.1.4 |
| Multi well Tissue Culture dishes | Corning | various | for use in cell culture, transfection/infection, and live cell imaging |
| Nikon Ti-E microscope | Nikon | Inverted epifluorescence microscope for use in live-cell imaging | |
| NIS Elements HC | Nikon | Version 4.51 | Image acquisition and analysis software; used in sections 3 & 4 |
| OPTI-MEM | Gibo-Life sciences | 31985-070 | Reduced serum medium for cell transfection; used in step 1.1.3 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibo-Life sciences | 15140-122 | antibiotic used in cell culture medium |
| phosphate bufferred saline (PBS) | Caisson labs | PBP06-10X1LT | sterile saline solution for use with cell culture |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Lentiviral VSV-G envelope expression construct; used in step 1.1.4 |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | Cationic polymer used to enhane viral infection efficiency; used in step 1.1.10 |
| psPAX | Addgene | 12260 | 2nd generation lentiviral packaging plasmid; used in step 1.1.4 |
| Puromycin | Invitrogen | ant-pr-1 | Antibiotic selection agent; used to select for RFP-H2B expressing cells |
| RFP- Histone 2B (H2B) | Addgene | various numbers | Expression vector for red fluorescent protein-tagged histone 2B; for use in the visualization of chromatin in live-cell imaging: commercially available through Addgene and other vendors |
| RNAi Max | Invitrogen | 13778-150 | Lipid based transfection reagent for transfection of siRNA constructs |
| RPE-1 cells | ATCC | CRL-4000 | Human retinal pigment epithelial cell line |
| Tissue culture dish 100x20mm | Corning | 353003 | for use in culturing adherent cells |
| Zyla sCMOS camera | Nikon | Camera attached to the micrscope, used for capturing images of cells |
References
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Cite This Article
Mercadante, D. L., Crowley, E. A., Manning, A. L. Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations. J. Vis. Exp. (151), e60255, doi:10.3791/60255 (2019).