Mitotik Mil Pertürbasyonları Sonrası Metafaz Zamanlaması ve Hücre KaderiniN Dinamiği Nin Dinamiği Nin Dinamitini Değerlendirmek Için Canlı Hücre Görüntülemesi
Summary
Burada mil oluşumu ve mitotik progresyon dinamiklerini değerlendirmek için bir protokol sıyoruz. Hızlandırılmış görüntüleme uygulamamız, kullanıcının mitozbölünmenin çeşitli aşamalarındaki hücreleri belirlemesini, mitotik defektleri izlemesini ve tanımlamasını ve anti-mitotik ilaçlara maruz kalındığında mil dinamiği ve mitotik hücre kaderini analiz etmesini sağlar.
Abstract
Canlı hücre zaman atlamalı görüntüleme, hücre biyolojisinde, sabit hücre analizi yle gözden kaçmış, yanlış anlaşılabilecek veya yanlış yorumlanabilecek hücresel süreçler hakkında bilgi sağlayan önemli bir araçtır. Sabit hücre görüntüleme ve analizi sağlam ve hücresel sabit durumu gözlemlemek için yeterli olmakla birlikte, hücresel düzeyde olayların zamansal bir sıratanımlayan sınırlı olabilir ve dahil olmak üzere dinamik süreçlerin geçici doğasını değerlendirmek için yetersiz donanımlı mitotik ilerleme. Buna karşılık, canlı hücre görüntüleme zaman içinde tek hücre düzeyinde hücresel süreçleri gözlemlemek için kullanılabilir ve aksi takdirde sabit hücre görüntüleme kötü temsil edilecek süreçlerin dinamiklerini yakalamak için kapasiteye sahip anlamlı bir araçtır. Burada, kromatin ve mikrotübüllerin floresan etiketli belirteçlerini taşıyan hücreler ve bunların metafaz kromozom hizasını ve mitotik çıkışı izlemek için canlı hücre görüntüleme yaklaşımlarında kullanılmasına yönelik bir yaklaşım açıklıyoruz. Mitoz bölünmede çeşitli evrelerde hücrelerin tanımlanması, mitotik defektlerin tanımlanması ve izlenmesi, mil dinamiğinin analizi ve mitotik inhibitörleri ile tedavi sonrasında mitotik hücre kaderi.
Introduction
Sabit hücrelerin görüntü tabanlı analizi genellikle çeşitli tedirginliklere yanıt olarak hücre popülasyon düzeyi değişikliklerini değerlendirmek için kullanılır. Hücre senkronizasyonu ile birleştirildiğinde, seri zaman noktalarının toplanması ve görüntülenmesi takip edildiğinde, bu tür yaklaşımlar olayların hücresel bir dizi önermek için kullanılabilir. Bununla birlikte, sabit hücre görüntüleme zamansal ilişkiler bir nüfus için ima ve bireysel hücrelerin düzeyinde gösterilmiştir sınırlıdır. Bu şekilde, sabit hücre görüntüleme ve analizi sağlam fenotipleri ve sabit durum değişikliklerini gözlemlemek için yeterli olmakla birlikte, zaman içinde geçici değişiklikleri algılama ve hücrelerin sadece bir alt popülasyonunu etkileyen değişiklikleri algılama yeteneği kusurludur. Buna karşılık, canlı hücre görüntüleme tek bir hücre içinde hücresel ve hücre altı süreçleri gözlemlemek için kullanılabilecek anlamlı bir araçtır, ya da hücresel nüfus, zaman içinde ve kendilerini hücresel davranışı etkileyebilir senkronizasyon yaklaşımları yardımı olmadan 1.1.2 , 2.000 , 3.2.2 , 4.2.2 , 5.000 , 6 .
Bipolar mitotik mil oluşumu hücre bölünmesi sırasında uygun kromozom ayrımı için gereklidir, iki genetik olarak özdeş kız hücreleri sonuçlanan. Mitotik mil yapısındaki, mitotik progresyonun bozulmasıve kromozom ayrımının doğruluğunu tehlikeye sokan kusurlar, hücre bölünmelerinin azalmasına ve hücre canlılığının azalmasına neden olabilir. Bu nedenle, mil oluşumunu değiştirmek mitotik zehirler kanser hücrelerinin hızlı çoğalmasını sınırlamak için umut verici terapötik ler vardır7,8,9. Bununla birlikte, mitotik zehirlerin eklenmesinden sonra mil yapısının sabit hücre analizi, mil oluşumunun dinamik sürecini değerlendirme yeteneği ile sınırlıdır ve mil yapısında gözlenen değişikliklerin kalıcı olup olmadığını veya bunun yerine geçici ve başarılı hücre bölünmesi izin üstesinden gelebilir.
Bu protokolde, canlı hücre görüntüleme ile mil pertürbasyonlarını takiben mitoz dinamiklerini değerlendirmek için bir yaklaşım açıklıyoruz. Mikrotübülleri görselleştirmek için EGFP etiketli α-tubulin ile birlikte, mikrotübülleri görselleştirmek için RFP etiketli Histon 2B’yi ifade etmek üzere tasarlanmış hTERT ölümsüzleştirilmiş RPE-1 hücre hattını kullanarak metafaz kromozom hizalamasının zamanlaması, anafaz başlangıcı ve nihayetinde mitotik hücre kaderi kromozom hareketi, sıkıştırma ve nükleer morfolojigörsel ipuçları kullanılarak değerlendirilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zaman atlamalı görüntüleme tarafından sağlanan zamansal çözünürlük, tek hücre içindeki ardışık hücresel olayların görselleştirilmesini ve değerlendirilmesini sağlar. Hücre senkronizasyonunu ve ardından hücrelerin ardışık zaman noktalarında toplanması ve fiksasyonundan yararlanan yaklaşımlar, sonuçta hücre popülasyonları arasında karşılaştırmalar yapılmasıyla sınırlıdır. Pertürbasyonlara hücresel yanıtın tekdüze olmadığı veya görselleştirilen sürecin dinamik olduğ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DLM bir NSF GRFP tarafından desteklenir. ALM, Smith Aile Biyomedikal Araştırmada Mükemmellik Ödülü’nden gelen fonla desteklenmiştir.
Materials
| 0.05% Trypsin | Gibo-Life sciences | 25-510 | A serine protease used to release adherent cells from culture dishes |
| 15ml centrifuge tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| 20x CFI Plan Fluor objective | Nikon | For use in Live-cell imaging to visualize both bright field and fluorescence | |
| 293T Cells | ATCC | CRL-3216 | For use in retroviral transfection; used in step 1.1 |
| a-tubulin-EGFP | Addgene | various numbers | Expression vector for alpha tubulin fused to a green fluorescent protein tag; for use in the visualization of tubulin in live-cell imaging: commercially available through addgene and other vendors |
| Alisertib | Selleckchem | S1133 | Small molecule inhibitor of the mitotic kinase Aurora A. Stock concentration is prepared at 10mM in DMSO, and used at a final concentration of 100nM. |
| Blasticidin | Invitrogen | A11139-03 | Antibiotic selection agent; used to select for a-tub-EGFP expressing cells |
| C02 | Airgas | For use in cell culture and live cell imaging | |
| Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3) | Chroma | 49005 | Single band filter set; excitation wavelength 545nm with 25nm bandwidth and emission at 605nm wavelength with 70nm bandwidth; for visualization of H2B-RFP |
| Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2) | Chroma | 49002 | Single band filter set; excitation wavelength 470nm with 40nm bandwidth and emission at 525nm wavelength with 50nm bandwidth; for visualization of GFP-tubulin |
| disposable glass Pastuer pipets, sterilized | Fisher Scientific | 13-678-6A | For use in aspirating cells |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibo-Life sciences | 11965-084 | Cell culture medium for growth of RPE-1 and 293T cells |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibo-Life sciences | 10438-026 | Cell culture medium supplement |
| Lipofectamine 3000 and p3000 | Invitrogen | L3000-015 | Lipid based transfection reagent for transfection of plasmids; used in 1.1.4 |
| Multi well Tissue Culture dishes | Corning | various | for use in cell culture, transfection/infection, and live cell imaging |
| Nikon Ti-E microscope | Nikon | Inverted epifluorescence microscope for use in live-cell imaging | |
| NIS Elements HC | Nikon | Version 4.51 | Image acquisition and analysis software; used in sections 3 & 4 |
| OPTI-MEM | Gibo-Life sciences | 31985-070 | Reduced serum medium for cell transfection; used in step 1.1.3 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibo-Life sciences | 15140-122 | antibiotic used in cell culture medium |
| phosphate bufferred saline (PBS) | Caisson labs | PBP06-10X1LT | sterile saline solution for use with cell culture |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Lentiviral VSV-G envelope expression construct; used in step 1.1.4 |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | Cationic polymer used to enhane viral infection efficiency; used in step 1.1.10 |
| psPAX | Addgene | 12260 | 2nd generation lentiviral packaging plasmid; used in step 1.1.4 |
| Puromycin | Invitrogen | ant-pr-1 | Antibiotic selection agent; used to select for RFP-H2B expressing cells |
| RFP- Histone 2B (H2B) | Addgene | various numbers | Expression vector for red fluorescent protein-tagged histone 2B; for use in the visualization of chromatin in live-cell imaging: commercially available through Addgene and other vendors |
| RNAi Max | Invitrogen | 13778-150 | Lipid based transfection reagent for transfection of siRNA constructs |
| RPE-1 cells | ATCC | CRL-4000 | Human retinal pigment epithelial cell line |
| Tissue culture dish 100x20mm | Corning | 353003 | for use in culturing adherent cells |
| Zyla sCMOS camera | Nikon | Camera attached to the micrscope, used for capturing images of cells |
References
- Szuts, D., Krude, T. Cell cycle arrest at the initiation step of human chromosomal DNA replication causes DNA damage. Journal of Cell Science. 117, 4897-4908 (2004).
- Gayek, A. S., Ohi, R. CDK-1 Inhibition in G2 Stabilizes Kinetochore-Microtubules in the following Mitosis. PLoS One. 11, e0157491 (2016).
- Mackay, D. R., Makise, M., Ullman, K. S. Defects in nuclear pore assembly lead to activation of an Aurora B-mediated abscission checkpoint. The Journal of Cell Biology. 191, 923-931 (2010).
- Cimini, D., Fioravanti, D., Salmon, E. D., Degrassi, F. Merotelic kinetochore orientation versus chromosome mono-orientation in the origin of lagging chromosomes in human primary cells. Journal of Cell Science. 115, 507-515 (2002).
- Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes. Genes & Development. 22, 2189-2203 (2008).
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, 2-16 (2006).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?. Journal of Cell Science. 122, 2579-2585 (2009).
- van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. Antimitotic drugs in the treatment of cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 76, 1101-1112 (2015).
- Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand. Cell Death and Diseases. 3, 411 (2012).
- Martin, M., Akhmanova, A. Coming into Focus: Mechanisms of Microtubule Minus-End Organization. Trends in Cell Biology. 28, 574-588 (2018).
- Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nature Cell Biology. 16, 386-394 (2014).
- Vitre, B. D., Cleveland, D. W. Centrosomes, chromosome instability (CIN) and aneuploidy. Current Opinion in Cell Biology. 24, 809-815 (2012).
- Godinho, S. A., Pellman, D. Causes and consequences of centrosome abnormalities in cancer. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369, (2014).
- Navarro-Serer, B., Childers, E. P., Hermance, N. M., Mercadante, D., Manning, A. L. Aurora A inhibition limits centrosome clustering and promotes mitotic catastrophe in cells with supernumerary centrosomes. Oncotarget. 10, 1649-1659 (2019).
- Conte, N., et al. TACC1-chTOG-Aurora A protein complex in breast cancer. Oncogene. 22, 8102-8116 (2003).
- Schumacher, J. M., Ashcroft, N., Donovan, P. J., Golden, A. A highly conserved centrosomal kinase, AIR-1, is required for accurate cell cycle progression and segregation of developmental factors in Caenorhabditis elegans embryos. Development. 125, 4391-4402 (1998).
- Asteriti, I. A., Giubettini, M., Lavia, P., Guarguaglini, G. Aurora-A inactivation causes mitotic spindle pole fragmentation by unbalancing microtubule-generated forces. Molecular Cancer. 10, 131 (2011).
- Chan, J. Y. A clinical overview of centrosome amplification in human cancers. International Journal of Biological Sciences. 7, 1122-1144 (2011).
- Kramer, A., Maier, B., Bartek, J. Centrosome clustering and chromosomal (in)stability: a matter of life and death. Molecular Oncology. 5, 324-335 (2011).
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
- Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells. PLoS One. 4, e6564 (2009).
- Nigg, E. A. Centrosome aberrations: cause or consequence of cancer progression?. Nature reviews, Cancer. 2, 815-825 (2002).
- Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes. Cancer Metastasis Reviews. 28, 85-98 (2009).
- Quintyne, N. J., Reing, J. E., Hoffelder, D. R., Gollin, S. M., Saunders, W. S. Spindle multipolarity is prevented by centrosomal clustering. Science. 307, 127-129 (2005).
- Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
