Live Cell Imaging per valutare la dinamica della temporizzazione metafase e del destino delle cellule a seguito di perturbazioni mitotiche del mandrino
Summary
Qui presentiamo un protocollo per valutare la dinamica della formazione del mandrino e della progressione mitotica. La nostra applicazione di imaging time-lapse consente all’utente di identificare le cellule in varie fasi della mitosi, monitorare e identificare i difetti mitotici e analizzare la dinamica del mandrino e il destino delle cellule mitotiche dopo l’esposizione a farmaci anti-mitotici.
Abstract
L’imaging time-lapse delle cellule vive è uno strumento importante nella biologia cellulare che fornisce informazioni sui processi cellulari che potrebbero altrimenti essere trascurati, fraintesi o mal interpretati dall’analisi a cellule fisse. Sebbene l’imaging e l’analisi delle celle fisse siano robuste e sufficienti per osservare lo stato costante cellulare, può essere limitata nella definizione di un ordine temporale di eventi a livello cellulare ed è mal equipaggiata per valutare la natura transitoria dei processi dinamici, tra cui progressione mitotica. Al contrario, l’imaging delle cellule vive è uno strumento eloquente che può essere utilizzato per osservare i processi cellulari a livello di singola cellula nel tempo e ha la capacità di catturare le dinamiche dei processi che altrimenti sarebbero scarsamente rappresentati nell’imaging di cellule fisse. Qui descriviamo un approccio per generare cellule che trasportano marcatori fluorescenti etichettati di cromatina e microtubuli e il loro uso in approcci di imaging a cellule vive per monitorare l’allineamento del cromosoma metafase e l’uscita mitotica. Descriviamo tecniche basate sull’imaging per valutare la dinamica della formazione del mandrino e della progressione mitotica, compresa l’identificazione delle cellule in varie fasi della mitosi, l’identificazione e il monitoraggio dei difetti mitotici, nonché l’analisi delle dinamiche del mandrino e il destino delle cellule mitotiche dopo il trattamento con inibitori mitotici.
Introduction
L’analisi basata sull’immagine delle cellule fisse è comunemente usata per valutare i cambiamenti del livello della popolazione cellulare in risposta a varie perturbazioni. In combinazione con la sincronizzazione delle celle, seguita dalla raccolta e dall’imaging di punti temporali seriali, tali approcci possono essere utilizzati per suggerire una sequenza cellulare di eventi. Tuttavia, l’imaging a cellule fisse è limitato in quanto le relazioni temporali sono implicite per una popolazione e non dimostrate a livello di singole cellule. In questo modo, mentre l’imaging e l’analisi delle cellule fisse sono sufficienti per osservare fenotipi robusti e cambiamenti di stato costante, la capacità di rilevare cambiamenti transitori nel tempo e cambiamenti che influenzano solo una sottopopolazione delle cellule è imperfetta. Al contrario, l’imaging delle cellule vive è uno strumento eloquente che può essere utilizzato per osservare i processi cellulari e subcellulari all’interno di una singola cellula, o popolazione cellulare, nel tempo e senza l’aiuto di approcci di sincronizzazione che possono avere un impatto sul comportamento cellulare 1 : il nome del , 2 Il nome del sistema , 3 (COM del nome , 4 DEL psu’ , 5 Del numero 3( , 6.
La formazione di un mandrino mitotico bipolare è essenziale per la corretta segregazione cromosomica durante la divisione cellulare, con conseguente due cellule figlie geneticamente identiche. I difetti nella struttura del mandrino mitotico che corrompono la progressione mitotica e compromettono la fedeltà della segregazione cromosomica possono portare a divisioni cellulari catastrofiche e a una riduzione della vitalità cellulare. Per questo motivo, i veleni mitotici che alterano la formazione del mandrino sono promettenti terapie per limitare la rapida proliferazione delle cellule tumorali7,8,9. Tuttavia, l’analisi a cellule fisse della struttura del mandrino dopo l’aggiunta di veleni mitotici è limitata nella sua capacità di valutare il processo dinamico di formazione del mandrino e non può indicare se i cambiamenti osservati nella struttura del mandrino sono permanenti o sono invece transitorio e può essere superato per consentire la divisione cellulare di successo.
In questo protocollo, descriviamo un approccio per valutare la dinamica della mitosi in seguito alle perturbazioni del mandrino mediante l’imaging delle cellule vive. Utilizzando la linea cellulare RPE-1 immortalata hTERT progettata per esprimere un Histone 2B con tag RFP per visualizzare la cromatina, insieme a una z-tubulina con tag EGFP per visualizzare i microtubuli, la tempistica dell’allineamento del cromosoma della metafase, l’insorgenza dell’anfase e, infine, l’insorgenza il destino delle cellule mitotiche viene valutato utilizzando segnali visivi di movimento cromosomico, compattazione e morfologia nucleare.
Protocol
Representative Results
Discussion
La risoluzione temporale fornita dall’imaging time-lapse consente la visualizzazione e la valutazione degli eventi cellulari sequenziali all’interno di singole cellule. Gli approcci che fanno uso della sincronizzazione cellulare seguita dalla raccolta e dalla fissazione delle cellule nei punti temporali sequenziali sono limitati in quanto i confronti vengono infine effettuati tra popolazioni di cellule. Nei contesti in cui la risposta cellulare alle perturbazioni può essere non uniforme, o in cui il processo visualizzat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DLM è supportato da una NSF GRFP. ALM è supportato dal finanziamento dello Smith Family Award for Excellence in Biomedical Research.
Materials
| 0.05% Trypsin | Gibo-Life sciences | 25-510 | A serine protease used to release adherent cells from culture dishes |
| 15ml centrifuge tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| 20x CFI Plan Fluor objective | Nikon | For use in Live-cell imaging to visualize both bright field and fluorescence | |
| 293T Cells | ATCC | CRL-3216 | For use in retroviral transfection; used in step 1.1 |
| a-tubulin-EGFP | Addgene | various numbers | Expression vector for alpha tubulin fused to a green fluorescent protein tag; for use in the visualization of tubulin in live-cell imaging: commercially available through addgene and other vendors |
| Alisertib | Selleckchem | S1133 | Small molecule inhibitor of the mitotic kinase Aurora A. Stock concentration is prepared at 10mM in DMSO, and used at a final concentration of 100nM. |
| Blasticidin | Invitrogen | A11139-03 | Antibiotic selection agent; used to select for a-tub-EGFP expressing cells |
| C02 | Airgas | For use in cell culture and live cell imaging | |
| Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3) | Chroma | 49005 | Single band filter set; excitation wavelength 545nm with 25nm bandwidth and emission at 605nm wavelength with 70nm bandwidth; for visualization of H2B-RFP |
| Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2) | Chroma | 49002 | Single band filter set; excitation wavelength 470nm with 40nm bandwidth and emission at 525nm wavelength with 50nm bandwidth; for visualization of GFP-tubulin |
| disposable glass Pastuer pipets, sterilized | Fisher Scientific | 13-678-6A | For use in aspirating cells |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibo-Life sciences | 11965-084 | Cell culture medium for growth of RPE-1 and 293T cells |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibo-Life sciences | 10438-026 | Cell culture medium supplement |
| Lipofectamine 3000 and p3000 | Invitrogen | L3000-015 | Lipid based transfection reagent for transfection of plasmids; used in 1.1.4 |
| Multi well Tissue Culture dishes | Corning | various | for use in cell culture, transfection/infection, and live cell imaging |
| Nikon Ti-E microscope | Nikon | Inverted epifluorescence microscope for use in live-cell imaging | |
| NIS Elements HC | Nikon | Version 4.51 | Image acquisition and analysis software; used in sections 3 & 4 |
| OPTI-MEM | Gibo-Life sciences | 31985-070 | Reduced serum medium for cell transfection; used in step 1.1.3 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibo-Life sciences | 15140-122 | antibiotic used in cell culture medium |
| phosphate bufferred saline (PBS) | Caisson labs | PBP06-10X1LT | sterile saline solution for use with cell culture |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Lentiviral VSV-G envelope expression construct; used in step 1.1.4 |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | Cationic polymer used to enhane viral infection efficiency; used in step 1.1.10 |
| psPAX | Addgene | 12260 | 2nd generation lentiviral packaging plasmid; used in step 1.1.4 |
| Puromycin | Invitrogen | ant-pr-1 | Antibiotic selection agent; used to select for RFP-H2B expressing cells |
| RFP- Histone 2B (H2B) | Addgene | various numbers | Expression vector for red fluorescent protein-tagged histone 2B; for use in the visualization of chromatin in live-cell imaging: commercially available through Addgene and other vendors |
| RNAi Max | Invitrogen | 13778-150 | Lipid based transfection reagent for transfection of siRNA constructs |
| RPE-1 cells | ATCC | CRL-4000 | Human retinal pigment epithelial cell line |
| Tissue culture dish 100x20mm | Corning | 353003 | for use in culturing adherent cells |
| Zyla sCMOS camera | Nikon | Camera attached to the micrscope, used for capturing images of cells |
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