Live Cell Imaging til at vurdere dynamikken i metafase timing og celle skæbne efter mitotiske spindel forstyrrelser
Summary
Her præsenterer vi en protokol til at vurdere dynamikken i spindel dannelse og mitotisk progression. Vores anvendelse af time-lapse Imaging gør det muligt for brugeren at identificere celler på forskellige stadier af mitose, spore og identificere mitotiske defekter, og analysere spindel dynamik og mitotiske celle skæbne ved udsættelse for anti-mitotiske lægemidler.
Abstract
Live Cell time-lapse Imaging er et vigtigt værktøj i cellebiologi, der giver indsigt i cellulære processer, der ellers kunne blive overset, misforstået, eller misfortolket af den faste celle analyse. Mens den faste celle afbildning og-analyse er robust og tilstrækkelig til at observere cellulær Steady-State, kan den begrænses ved at definere en tidsmæssig rækkefølge af hændelser på cellulært niveau og er dårligt rustet til at vurdere de dynamiske processers forbigående karakter, herunder mitotisk progression. I modsætning hertil er live Cell Imaging et veltalende værktøj, der kan bruges til at observere cellulære processer på enkelt celleniveau over tid og har kapacitet til at fange dynamikken i processer, der ellers ville være dårligt repræsenteret i faste celle billeder. Her beskriver vi en tilgang til at generere celler transporterer fluorescently mærkede markører af kromatin og microtubuler og deres anvendelse i levende celle Imaging tilgange til at overvåge Metaponto kromosom justering og mitotisk udgang. Vi beskriver Imaging-baserede teknikker til at vurdere dynamikken i spindel dannelse og mitotisk progression, herunder identifikation af celler på forskellige stadier i mitose, identifikation og sporing af mitotiske defekter, og analyse af spindel dynamik og mitotiske celle skæbne efter behandling med mitotiske hæmmere.
Introduction
Billedbaseret analyse af faste celler bruges almindeligvis til at vurdere celle populationsniveau ændringer som reaktion på forskellige perturbationer. Når det kombineres med celle synkronisering, efterfulgt af indsamling og billeddannelse af serielle tidspunkter, kan sådanne tilgange bruges til at foreslå en cellulær sekvens af begivenheder. Ikke desto mindre er faste celle billeder begrænset i, at tidsmæssige forhold er underforstået for en population og ikke påvist på niveauet af individuelle celler. På denne måde, mens fast celle billeddannelse og analyse er tilstrækkelig til at observere robuste fænotyper og Steady-State ændringer, evnen til at detektere forbigående ændringer over tid og ændringer, der påvirker kun en delpopulation af cellerne er ufuldkomment. I modsætning hertil er live Cell Imaging et veltalende værktøj, der kan bruges til at observere cellulære og subcellulære processer i en enkelt celle, eller cellulære befolkning, over tid og uden hjælp af synkronisering tilgange, der kan selv påvirke cellulære adfærd 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6.
Dannelsen af en bipolær mitotisk spindel er afgørende for den korrekte kromosom adskillelse under celledelingen, hvilket resulterer i to genetisk identiske datter celler. Defekter i mitotisk spindel struktur, der korrupte mitotiske progression og kompromittere trofasthed af kromosom segregation kan resultere i katastrofale celle divisioner og reduceret cellelevedygtighed. Af denne grund, mitotiske giftstoffer, der ændrer spindel dannelse er lovende Therapeutics at begrænse den hurtige spredning af kræftceller7,8,9. Ikke desto mindre er en fast celle analyse af spindel strukturen efter tilsætning af mitotiske gifte begrænset i dens evne til at vurdere den dynamiske proces med spindel dannelse og kan ikke indikere, om observerede ændringer i spindel strukturen er permanente eller i stedet forbigående og kan overvindes for at tillade succesfuld celledeling.
I denne protokol beskriver vi en tilgang til at vurdere dynamikken i mitose efter spindel forstyrrelser ved Live Cell Imaging. Ved hjælp af hTERT udødeliggjort rpe-1 cellelinje konstrueret til at udtrykke en RFP-Tagged histone 2b at visualisere kromatin, sammen med en egfp-Tagged α-Tubulin at visualisere microtubuler, timingen af Metaponto kromosom justering, anafylanindebut, og i sidste ende mitotiske celle skæbne vurderes ved hjælp af visuelle signaler af kromosom bevægelse, komprimering og nuklear morfologi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den tidsmæssige opløsning, der leveres af time-lapse Imaging giver mulighed for visualisering og vurdering af sekventielle cellulære begivenheder inden for enkeltceller. Tilgange, der gør brug af cellulære synkronisering efterfulgt af indsamling og fiksering af celler i sekventielle tidspunkter er begrænset i, at sammenligninger er i sidste ende foretaget mellem populationer af celler. I sammenhænge, hvor cellulær respons på forstyrrelser kan være ikke-ensartet, eller hvor den proces, der visualiseres, er dynam…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DLM understøttes af en NSF GRFP. ALM understøttes af finansiering fra Smith-familie prisen for topkvalitet inden for biomedicinsk forskning.
Materials
| 0.05% Trypsin | Gibo-Life sciences | 25-510 | A serine protease used to release adherent cells from culture dishes |
| 15ml centrifuge tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| 20x CFI Plan Fluor objective | Nikon | For use in Live-cell imaging to visualize both bright field and fluorescence | |
| 293T Cells | ATCC | CRL-3216 | For use in retroviral transfection; used in step 1.1 |
| a-tubulin-EGFP | Addgene | various numbers | Expression vector for alpha tubulin fused to a green fluorescent protein tag; for use in the visualization of tubulin in live-cell imaging: commercially available through addgene and other vendors |
| Alisertib | Selleckchem | S1133 | Small molecule inhibitor of the mitotic kinase Aurora A. Stock concentration is prepared at 10mM in DMSO, and used at a final concentration of 100nM. |
| Blasticidin | Invitrogen | A11139-03 | Antibiotic selection agent; used to select for a-tub-EGFP expressing cells |
| C02 | Airgas | For use in cell culture and live cell imaging | |
| Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3) | Chroma | 49005 | Single band filter set; excitation wavelength 545nm with 25nm bandwidth and emission at 605nm wavelength with 70nm bandwidth; for visualization of H2B-RFP |
| Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2) | Chroma | 49002 | Single band filter set; excitation wavelength 470nm with 40nm bandwidth and emission at 525nm wavelength with 50nm bandwidth; for visualization of GFP-tubulin |
| disposable glass Pastuer pipets, sterilized | Fisher Scientific | 13-678-6A | For use in aspirating cells |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibo-Life sciences | 11965-084 | Cell culture medium for growth of RPE-1 and 293T cells |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibo-Life sciences | 10438-026 | Cell culture medium supplement |
| Lipofectamine 3000 and p3000 | Invitrogen | L3000-015 | Lipid based transfection reagent for transfection of plasmids; used in 1.1.4 |
| Multi well Tissue Culture dishes | Corning | various | for use in cell culture, transfection/infection, and live cell imaging |
| Nikon Ti-E microscope | Nikon | Inverted epifluorescence microscope for use in live-cell imaging | |
| NIS Elements HC | Nikon | Version 4.51 | Image acquisition and analysis software; used in sections 3 & 4 |
| OPTI-MEM | Gibo-Life sciences | 31985-070 | Reduced serum medium for cell transfection; used in step 1.1.3 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibo-Life sciences | 15140-122 | antibiotic used in cell culture medium |
| phosphate bufferred saline (PBS) | Caisson labs | PBP06-10X1LT | sterile saline solution for use with cell culture |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Lentiviral VSV-G envelope expression construct; used in step 1.1.4 |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | Cationic polymer used to enhane viral infection efficiency; used in step 1.1.10 |
| psPAX | Addgene | 12260 | 2nd generation lentiviral packaging plasmid; used in step 1.1.4 |
| Puromycin | Invitrogen | ant-pr-1 | Antibiotic selection agent; used to select for RFP-H2B expressing cells |
| RFP- Histone 2B (H2B) | Addgene | various numbers | Expression vector for red fluorescent protein-tagged histone 2B; for use in the visualization of chromatin in live-cell imaging: commercially available through Addgene and other vendors |
| RNAi Max | Invitrogen | 13778-150 | Lipid based transfection reagent for transfection of siRNA constructs |
| RPE-1 cells | ATCC | CRL-4000 | Human retinal pigment epithelial cell line |
| Tissue culture dish 100x20mm | Corning | 353003 | for use in culturing adherent cells |
| Zyla sCMOS camera | Nikon | Camera attached to the micrscope, used for capturing images of cells |
References
- Szuts, D., Krude, T. Cell cycle arrest at the initiation step of human chromosomal DNA replication causes DNA damage. Journal of Cell Science. 117, 4897-4908 (2004).
- Gayek, A. S., Ohi, R. CDK-1 Inhibition in G2 Stabilizes Kinetochore-Microtubules in the following Mitosis. PLoS One. 11, e0157491 (2016).
- Mackay, D. R., Makise, M., Ullman, K. S. Defects in nuclear pore assembly lead to activation of an Aurora B-mediated abscission checkpoint. The Journal of Cell Biology. 191, 923-931 (2010).
- Cimini, D., Fioravanti, D., Salmon, E. D., Degrassi, F. Merotelic kinetochore orientation versus chromosome mono-orientation in the origin of lagging chromosomes in human primary cells. Journal of Cell Science. 115, 507-515 (2002).
- Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes. Genes & Development. 22, 2189-2203 (2008).
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, 2-16 (2006).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?. Journal of Cell Science. 122, 2579-2585 (2009).
- van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. Antimitotic drugs in the treatment of cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 76, 1101-1112 (2015).
- Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand. Cell Death and Diseases. 3, 411 (2012).
- Martin, M., Akhmanova, A. Coming into Focus: Mechanisms of Microtubule Minus-End Organization. Trends in Cell Biology. 28, 574-588 (2018).
- Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nature Cell Biology. 16, 386-394 (2014).
- Vitre, B. D., Cleveland, D. W. Centrosomes, chromosome instability (CIN) and aneuploidy. Current Opinion in Cell Biology. 24, 809-815 (2012).
- Godinho, S. A., Pellman, D. Causes and consequences of centrosome abnormalities in cancer. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369, (2014).
- Navarro-Serer, B., Childers, E. P., Hermance, N. M., Mercadante, D., Manning, A. L. Aurora A inhibition limits centrosome clustering and promotes mitotic catastrophe in cells with supernumerary centrosomes. Oncotarget. 10, 1649-1659 (2019).
- Conte, N., et al. TACC1-chTOG-Aurora A protein complex in breast cancer. Oncogene. 22, 8102-8116 (2003).
- Schumacher, J. M., Ashcroft, N., Donovan, P. J., Golden, A. A highly conserved centrosomal kinase, AIR-1, is required for accurate cell cycle progression and segregation of developmental factors in Caenorhabditis elegans embryos. Development. 125, 4391-4402 (1998).
- Asteriti, I. A., Giubettini, M., Lavia, P., Guarguaglini, G. Aurora-A inactivation causes mitotic spindle pole fragmentation by unbalancing microtubule-generated forces. Molecular Cancer. 10, 131 (2011).
- Chan, J. Y. A clinical overview of centrosome amplification in human cancers. International Journal of Biological Sciences. 7, 1122-1144 (2011).
- Kramer, A., Maier, B., Bartek, J. Centrosome clustering and chromosomal (in)stability: a matter of life and death. Molecular Oncology. 5, 324-335 (2011).
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
- Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells. PLoS One. 4, e6564 (2009).
- Nigg, E. A. Centrosome aberrations: cause or consequence of cancer progression?. Nature reviews, Cancer. 2, 815-825 (2002).
- Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes. Cancer Metastasis Reviews. 28, 85-98 (2009).
- Quintyne, N. J., Reing, J. E., Hoffelder, D. R., Gollin, S. M., Saunders, W. S. Spindle multipolarity is prevented by centrosomal clustering. Science. 307, 127-129 (2005).
- Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
