Live Cell Imaging å vurdere dynamikken i Metafase timing og Cell Fate etter mitotisk spindel forstyrrelser
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å vurdere dynamikken i spindel dannelse og mitotisk progresjon. Vår anvendelse av time-lapse Imaging gjør det mulig for brukeren å identifisere celler på ulike stadier av mitose, spore og identifisere mitotisk defekter, og analysere spindel dynamikk og mitotisk celle skjebne ved eksponering for anti-mitotisk narkotika.
Abstract
Live celle time-lapse Imaging er et viktig verktøy i cellebiologi som gir innsikt i cellulære prosesser som ellers kan bli oversett, misforstått, eller misforstått av fast celle analyse. Mens den faste celle bilde og analyse er robust og tilstrekkelig til å observere mobilnettet steady-state, kan det være begrenset i å definere en timelig rekkefølge av hendelser på cellenivå og er dårlig rustet til å vurdere forbigående natur dynamiske prosesser inkludert mitotisk progresjon. I kontrast er live celle Imaging en veltalende verktøy som kan brukes til å observere cellulære prosesser på single-cellenivå over tid og har kapasitet til å fange dynamikken i prosesser som ellers ville være dårlig representert i fast celle Imaging. Her beskriver vi en tilnærming for å generere celler bærer fluorescensmerkete merket markører for kromatin og mikrotubuli og deres bruk i live celle Imaging tilnærminger til å overvåke metafase kromosom justering og mitotisk exit. Vi beskriver Imaging-baserte teknikker for å vurdere dynamikken i spindel dannelse og mitotisk progresjon, inkludert identifisering av celler på ulike stadier i mitose, identifisering og sporing av mitotisk defekter, og analyse av spindel dynamikk og mitotisk celle skjebne etter behandling med mitotisk hemmere.
Introduction
Bildebasert analyse av faste celler brukes vanligvis til å vurdere celle befolkningsnivå endringer som svar på ulike forstyrrelser. Når det kombineres med celle synkronisering, etterfulgt av innsamling og bildebehandling av serielle tids punkt, kan slike tilnærminger brukes til å foreslå en mobil sekvens av hendelser. Likevel er fast celle bilde begrenset i at timelige forhold er underforstått for en befolkning og ikke demonstrert på nivå med individuelle celler. På denne måten, mens fast celle bilde og analyse er tilstrekkelig til å observere robuste fenotyper og steady-state endringer, evnen til å oppdage forbigående endringer over tid og endringer som påvirker bare en pasientpopulasjonen av cellene er ufullkommen. I kontrast er live celle Imaging en veltalende verktøy som kan brukes til å observere cellulære og subcellulære prosesser innenfor en enkelt celle, eller mobilnettet befolkning, over tid og uten hjelp av synkronisering tilnærminger som kan selv påvirke cellulære atferd 1 den andre , 2 andre priser , 3 andre priser , 4 andre priser , 5 andre priser , 6i den.
Dannelsen av en bipolar mitotisk spindel er avgjørende for riktig kromosom segregering under celledeling, noe som resulterer i to genetisk identiske datter celler. Defekter i mitotisk spindel struktur som korrupte mitotisk progresjon og kompromiss troskap av kromosom segregering kan føre til katastrofale celle divisjoner og redusert celle levedyktighet. Av denne grunn er mitotisk gifter som endrer spindel formasjon lovende legemiddel selskap for å begrense den raske spredning av kreftceller7,8,9. Likevel er fast celle analyse av spindel struktur etter tilsetning av mitotisk gifter begrenset i sin evne til å vurdere den dynamiske prosessen med spindel formasjon og kan ikke indikere om observerte endringer i spindel strukturen er permanent eller er stedet forbigående og kan overvinnes for å tillate vellykket celledeling.
I denne protokollen, beskriver vi en tilnærming for å vurdere dynamikken i mitose etter spindel forstyrrelser av Live celle Imaging. Bruke hTERT udødeliggjort RPE-1 cellelinje konstruert for å uttrykke en RFP-Tagged histone 2B å visualisere kromatin, sammen med en EGFP-Tagged α-tubulin å visualisere mikrotubuli, tidspunktet for metafase kromosom justering, anaphase utbruddet, og til slutt mitotisk celle skjebne er vurdert ved hjelp av visuelle signaler av kromosom bevegelse, komprimering og kjernefysisk morfologi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den timelige oppløsningen gitt av tidsforløp Imaging tillater visualisering og vurdering av sekvensielle cellulære hendelser i enkeltceller. Tilnærminger som gjør bruk av mobilnettet synkronisering etterfulgt av innsamling og fiksering av celler på sekvensielle tids punkt er begrenset i at sammenligninger er til syvende og sist gjort mellom populasjoner av celler. I sammenhenger der mobilnettet respons på forstyrrelser kan være ikke-uniform, eller hvor prosessen blir visualisere er dynamisk, er live celle time-la…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DLM støttes av en NSF GRFP. ALM er støttet av finansiering fra Smith Family Award for Excellence in Biomedical Research.
Materials
| 0.05% Trypsin | Gibo-Life sciences | 25-510 | A serine protease used to release adherent cells from culture dishes |
| 15ml centrifuge tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| 20x CFI Plan Fluor objective | Nikon | For use in Live-cell imaging to visualize both bright field and fluorescence | |
| 293T Cells | ATCC | CRL-3216 | For use in retroviral transfection; used in step 1.1 |
| a-tubulin-EGFP | Addgene | various numbers | Expression vector for alpha tubulin fused to a green fluorescent protein tag; for use in the visualization of tubulin in live-cell imaging: commercially available through addgene and other vendors |
| Alisertib | Selleckchem | S1133 | Small molecule inhibitor of the mitotic kinase Aurora A. Stock concentration is prepared at 10mM in DMSO, and used at a final concentration of 100nM. |
| Blasticidin | Invitrogen | A11139-03 | Antibiotic selection agent; used to select for a-tub-EGFP expressing cells |
| C02 | Airgas | For use in cell culture and live cell imaging | |
| Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3) | Chroma | 49005 | Single band filter set; excitation wavelength 545nm with 25nm bandwidth and emission at 605nm wavelength with 70nm bandwidth; for visualization of H2B-RFP |
| Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2) | Chroma | 49002 | Single band filter set; excitation wavelength 470nm with 40nm bandwidth and emission at 525nm wavelength with 50nm bandwidth; for visualization of GFP-tubulin |
| disposable glass Pastuer pipets, sterilized | Fisher Scientific | 13-678-6A | For use in aspirating cells |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibo-Life sciences | 11965-084 | Cell culture medium for growth of RPE-1 and 293T cells |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibo-Life sciences | 10438-026 | Cell culture medium supplement |
| Lipofectamine 3000 and p3000 | Invitrogen | L3000-015 | Lipid based transfection reagent for transfection of plasmids; used in 1.1.4 |
| Multi well Tissue Culture dishes | Corning | various | for use in cell culture, transfection/infection, and live cell imaging |
| Nikon Ti-E microscope | Nikon | Inverted epifluorescence microscope for use in live-cell imaging | |
| NIS Elements HC | Nikon | Version 4.51 | Image acquisition and analysis software; used in sections 3 & 4 |
| OPTI-MEM | Gibo-Life sciences | 31985-070 | Reduced serum medium for cell transfection; used in step 1.1.3 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibo-Life sciences | 15140-122 | antibiotic used in cell culture medium |
| phosphate bufferred saline (PBS) | Caisson labs | PBP06-10X1LT | sterile saline solution for use with cell culture |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Lentiviral VSV-G envelope expression construct; used in step 1.1.4 |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | Cationic polymer used to enhane viral infection efficiency; used in step 1.1.10 |
| psPAX | Addgene | 12260 | 2nd generation lentiviral packaging plasmid; used in step 1.1.4 |
| Puromycin | Invitrogen | ant-pr-1 | Antibiotic selection agent; used to select for RFP-H2B expressing cells |
| RFP- Histone 2B (H2B) | Addgene | various numbers | Expression vector for red fluorescent protein-tagged histone 2B; for use in the visualization of chromatin in live-cell imaging: commercially available through Addgene and other vendors |
| RNAi Max | Invitrogen | 13778-150 | Lipid based transfection reagent for transfection of siRNA constructs |
| RPE-1 cells | ATCC | CRL-4000 | Human retinal pigment epithelial cell line |
| Tissue culture dish 100x20mm | Corning | 353003 | for use in culturing adherent cells |
| Zyla sCMOS camera | Nikon | Camera attached to the micrscope, used for capturing images of cells |
References
- Szuts, D., Krude, T. Cell cycle arrest at the initiation step of human chromosomal DNA replication causes DNA damage. Journal of Cell Science. 117, 4897-4908 (2004).
- Gayek, A. S., Ohi, R. CDK-1 Inhibition in G2 Stabilizes Kinetochore-Microtubules in the following Mitosis. PLoS One. 11, e0157491 (2016).
- Mackay, D. R., Makise, M., Ullman, K. S. Defects in nuclear pore assembly lead to activation of an Aurora B-mediated abscission checkpoint. The Journal of Cell Biology. 191, 923-931 (2010).
- Cimini, D., Fioravanti, D., Salmon, E. D., Degrassi, F. Merotelic kinetochore orientation versus chromosome mono-orientation in the origin of lagging chromosomes in human primary cells. Journal of Cell Science. 115, 507-515 (2002).
- Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes. Genes & Development. 22, 2189-2203 (2008).
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, 2-16 (2006).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?. Journal of Cell Science. 122, 2579-2585 (2009).
- van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. Antimitotic drugs in the treatment of cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 76, 1101-1112 (2015).
- Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand. Cell Death and Diseases. 3, 411 (2012).
- Martin, M., Akhmanova, A. Coming into Focus: Mechanisms of Microtubule Minus-End Organization. Trends in Cell Biology. 28, 574-588 (2018).
- Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nature Cell Biology. 16, 386-394 (2014).
- Vitre, B. D., Cleveland, D. W. Centrosomes, chromosome instability (CIN) and aneuploidy. Current Opinion in Cell Biology. 24, 809-815 (2012).
- Godinho, S. A., Pellman, D. Causes and consequences of centrosome abnormalities in cancer. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369, (2014).
- Navarro-Serer, B., Childers, E. P., Hermance, N. M., Mercadante, D., Manning, A. L. Aurora A inhibition limits centrosome clustering and promotes mitotic catastrophe in cells with supernumerary centrosomes. Oncotarget. 10, 1649-1659 (2019).
- Conte, N., et al. TACC1-chTOG-Aurora A protein complex in breast cancer. Oncogene. 22, 8102-8116 (2003).
- Schumacher, J. M., Ashcroft, N., Donovan, P. J., Golden, A. A highly conserved centrosomal kinase, AIR-1, is required for accurate cell cycle progression and segregation of developmental factors in Caenorhabditis elegans embryos. Development. 125, 4391-4402 (1998).
- Asteriti, I. A., Giubettini, M., Lavia, P., Guarguaglini, G. Aurora-A inactivation causes mitotic spindle pole fragmentation by unbalancing microtubule-generated forces. Molecular Cancer. 10, 131 (2011).
- Chan, J. Y. A clinical overview of centrosome amplification in human cancers. International Journal of Biological Sciences. 7, 1122-1144 (2011).
- Kramer, A., Maier, B., Bartek, J. Centrosome clustering and chromosomal (in)stability: a matter of life and death. Molecular Oncology. 5, 324-335 (2011).
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
- Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells. PLoS One. 4, e6564 (2009).
- Nigg, E. A. Centrosome aberrations: cause or consequence of cancer progression?. Nature reviews, Cancer. 2, 815-825 (2002).
- Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes. Cancer Metastasis Reviews. 28, 85-98 (2009).
- Quintyne, N. J., Reing, J. E., Hoffelder, D. R., Gollin, S. M., Saunders, W. S. Spindle multipolarity is prevented by centrosomal clustering. Science. 307, 127-129 (2005).
- Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
