توصيف آثار مثبطات Migrastatic على غزو الورم 3D Spheroid من قبل عالية الدقة المجهرية البؤرية

Summary

تتميز آثار مثبطات الميغراستاتيك على هجرة الخلايا السرطانية في اختبار الغزو ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) باستخدام مثبطات الأسيتيليلاز الهيستون (HDAC) بالفحص المجهري البؤري عالي الدقة.

Abstract

ويتزايد الاستناد إلى اكتشاف المخدرات وتطويرها في بحوث السرطان على شاشات المخدرات في شكل ثلاثي الأبعاد. ويجري اكتشاف مثبطات جديدة تستهدف إمكانات الخلايا السرطانية المهاجرة والغازية، وبالتالي الانتشار النقيلي للمرض، وتعتبر علاجات تكميلية في أنواع السرطان الشديدة التوغل مثل الأورام الدبقية. وبالتالي، فإن توليد البيانات التي تمكن من إجراء تحليلات مفصلة للخلايا في بيئة ثلاثية الجوانب بعد إضافة دواء مطلوب. المنهجية الموصوفة هنا، التي تجمع بين اختبار غزو البشيرويد والتقاط الصور عالية الدقة وتحليل البيانات عن طريق الفحص المجهري المسح الضوئي بالليزر (CLSM)، مكنت من توصيف مفصل لآثار مثبطات مكافحة الهجرة المحتملة MI-192 على خلايا الورم الدبقي. تم إنشاء Spheroids من خطوط الخلايا لتجارب الغزو في لوحات 96 جيدا الالتزام منخفضة ومن ثم أعدت لتحليل CLSM. وقد تم تفضيل سير العمل الموصوف على تقنيات أخرى شائعة الاستخدام لتوليد السفيرويد بسبب سهولة واستنساخ. هذا، جنبا إلى جنب مع دقة الصورة المحسنة التي تم تحقيقها عن طريق الفحص المجهري البؤري مقارنة مع النهج التقليدية واسعة المجال، سمح بتحديد وتحليل التغيرات المورفولوجية المتميزة في الخلايا المهاجرة في بيئة ثلاثية الأبعاد بعد العلاج مع المخدرات mi-192 mi.

Introduction

ويتزايد تفضيل التكنولوجيات الثلاثية الأبعاد لاكتشاف المخدرات قبل السريرية وتطوير أدوية السرطان المحتملة على شاشات الأدوية التقليدية؛ وبالتالي، هناك المزيد من التنمية من migrastatic – الهجرة ومنع الغزو – المخدرات. الأساس المنطقي وراء هذه التطورات في علاج السرطان واضحة: 3D sheroid الاختبارات تمثل نهجا أكثر واقعية لفحص الأدوية المضادة للسرطان المحتملة لأنها تحاكي الهندسة المعمارية الورم 3D أكثر إخلاصا من الثقافات الخلية أحادية الطبقة، تلخيص التفاعلات بين المخدرات والورم (الحركية) بشكل أكثر دقة، والسماح بتوصيف نشاط الدواء في بيئة ذات صلة الورم. وبالإضافة إلى ذلك، فإن ارتفاع مقاومة الأدوية السامة للسموم الكيميائية في العديد من أنواع السرطان وارتفاع معدلات الوفيات بين مرضى السرطان بسبب الانبثاث القوى من خلال قدرة الخلايا السرطانية على الهجرة إلى مواقع الورم البعيدة يدعم إدراج عوامل العلاج الكيميائي استهداف إمكانات الهجرة من الخلايا السرطانية كعلاج مساعد في تجارب السرطان السريرية في المستقبل¹. وهذا هو الحال بشكل خاص في السرطانات الغازية للغاية، مثل الأورام الدبقية عالية الجودة (GBM). تشمل إدارة GBM الجراحة والعلاج الإشعاعي والعلاج الكيميائي. ومع ذلك، حتى مع الجمع بين العلاج، فإن معظم المرضى الانتكاس في غضون 1 سنة من التشخيص الأولي مع البقاء على قيد الحياة متوسط من 11-15 شهرا^2،3. وقد أحرز تقدم كبير في مجال التكنولوجيا 3D على مدى السنوات القليلة الماضية: نظم دوارة، وهياكل مجهقلة والسقالات 3D، ويجري تحسين الاختبارات الفردية الأخرى باستمرار للسماح بإجراء اختبارات روتينية على نطاق واسع^{4، 5و6و7.} ومع ذلك، يجب تحليل النتائج التي تم الحصول عليها من هذه الاختبارات بطريقة مجدية لأن تفسير البيانات غالباً ما يعوقه محاولات تحليل البيانات التي تم إنشاؤها ثلاثية الأبعاد مع أنظمة تحليل الصور ثلاثية الأبعاد.

وعلى الرغم من أن معظم النظم الواسعة النطاق لا تزال محدودة بموجب القرار^8،على الرغم من أنها أفضل من حيث سرعة الحصول على الصور وانخفاض سمية الصورة. وهكذا، وبصرف النظر عن البيانات قراءة الخروج المتعلقة بفعالية المخدرات، والآثار التفصيلية للعمل المخدرات على الهياكل الخلوية 3D من الخلايا المهاجرة تضيع حتما إذا تم تصويرها باستخدام نظام واسع المجال. وعلى العكس من ذلك، يلتقط الفحص المجهري للمسح الضوئي بالليزر (CLSM) صورًا عالية الجودة ومقطعة بصريًا يمكن إعادة بنائها وتقديمها في مرحلة ما بعد الاكتساب ثلاثية الأبعاد باستخدام برامج الكمبيوتر. وهكذا، فإن CLSM ينطبق بسهولة على الهياكل الخلوية ثلاثية الأبعاد المعقدة التصويرية، مما يتيح التحقيق في آثار مثبطات مضادة للميثاستاتيك على الهياكل ثلاثية الأبعاد والتحليلات المتعمقة لآليات هجرة الخلايا. ومما لا شك فيه أن هذا سيوجه تطوير العقاقير الميجراستاتيكية في المستقبل. هنا، يتم وصف سير العمل مجتمعة من جيل spheroid، والعلاج من المخدرات، بروتوكول تلطيخ، والتوصيف عن طريق الفحص المجهري البؤري عالية الدقة.

Protocol

1. توليد من Spheroids الخلية اليوم الأول إعداد وسط الثقافة القياسية كما هو مطلوب من قبل خط الخلية قيد التحقيق. تنفيذ جميع الخطوات المرتبطة بزراعة الأنسجة في غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة باستخدام تقنيات المناولة المعقمة. التجرب وحساب الخلايا السرطان?…

Representative Results

تعمل تقنية spheroid ثلاثية الأبعاد على تعزيز فهم التفاعلات بين المخدرات والورم لأنها أكثر تمثيلاً للبيئة الخاصة بالسرطان. ويمكن تحقيق جيل من spheroids في عدة طرق. تم استخدام لوحات 96 جيدا منخفضة في هذا البروتوكول. بعد اختبار العديد من المنتجات من مختلف الشركات المصنعة، تم اختيار ?…

Discussion

يتم وصف طريقة جديدة لخلق spheroids الخلايا السرطانية لتحديد نشاط المخدرات migrastatic باستخدام الفحص المجهري البؤري عالية الدقة. وقد سهل استخدام لوحات منخفضة الالتزام على تقنيات أخرى، مثل قطرات شنقا^15،وسيلة لتوليد spheroids قابلة للاستنساخ وموحدة لاستخدامها في هجرة الكولاجين وتجارب الغز…

Materials

Collagen I, rat tail, 100 mg	Corning	354236	for glioma invasion assay; this is offered by many distributors/manufacturers and will need to be determined for both the type of assay intended and cell lines used. For glioma cancer cell lines Collagen rat tail type 1 ( e.g. Corning) is the preferred choice. Collagen should be stored at 4oC, in the dark, until required. It is not advisable to mix collagen from different batches as this may affect the consistency of the polymerized collagen.
Coverslips	various	various	for microscopy imaging
DMEM powder	Sigma	D5648	needed at 5X concentration for collagen solution for glioma invasion assay;  this may be purchased in powdered form, made up in double distilled water and, depending upon final composition of the growth medium, completed with any additives required. The complete 5X solution should be filtered through a syringe filter system (0.22 microns) before use.
Foetal calf serum	Sigma	F7524-500ML	needed for cell culture of glioma cell lines
Glass slides	various	various	for microscopy imaging
High glucose DMEM	Gibco	41965062	needed for cell culture of glioma cell lines
Inhibitor	Tocris	various	various – according to experimental design; inhibitors can be purchased from manufacturers such as Selleckchem and Tocris. These manufacturers offer detailed description of inhibitor characteristics, links to associated references and suggestion of working concentrations. As with all inhibitors, they may be potentially toxic and should be handled according to health and safety guidelines. Inhibitors are prepared as stock solutions as recommended by the manufacturer. As an example we used the migrastatic inhibitor MI-192 to demonstrate the use of such inhibitors. We have tested a range of migrastatic inhibitors in this way with comparable results.
Mountant	various	various	for microscopic imaging
NaOH (1 M)	various	various	NaOH can be either purchased at the required molarity or prepared from solid form. The prepared solution should be filter sterilized using a syringe filter system. One M NaOH is corrosive and care should be taken during solution preparation.
Paraformaldehyde	various	various	for fixing spheroids and cells; make up at 4%, caution health hazard, ensure that health and safety regulations are adhered to for collagen solution for invasion assay
Pastettes (graduated pipette, 3ml)	various	various	for invasion assay, solution removal
PBS, sterile for tissue culture	Sigma	D1408-500ML	needed for cell culture of glioma cell lines and washes for staining
Pen/strep (antibiotics)	Sigma	P4333	needed for cell culture of glioma cell lines
Primary antibody, secondary antibody, DAPI, Phalloidin	various	various	there are many manufacturers for these reagents, for secondary labelled antibodies we recommend Alexa Fluor (Molecular Probes). Here we used for primary antibodies mouse anti-acetylated tubulin antibody (1/100, Abcam). For secondary antibodies we used 1/500 anti-mouse Alexa Fluor 488 conjugated antibody, Molecular Probes. For nuclear stain we used DAPI (many manufacturers) and the actin stain Phalloidin (many manufacturers) both used at recommended dilution of 1/500.
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761	needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5X concentration
Sodium pyruvate	Sigma	P5280	needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5X concentration
Trypsin	Sigma	T4049	for trypsinisation
Ultra low attachment plates	Sigma/Nunc	CLS7007-24EA	for glioma invasion assay; a low adherent plate is required, with 96-well plates preferred to allow for large-scale screening of compounds under investigation. There are several low adherence plates commercially available; it is advisable to test a variety of plates for optimum spheroid generation. In our experience Costar Ultra Low Cluster with lid, round bottom, works best for the generation of spheroids from glioma cancer cells in terms of 100% spheroid formation and reproducibility. These plates were also successfully used for the generation of glioma spheroids from patient-derived material, bladder and ovarian cancer cells in our laboratory. In addition, stem or progenitor neurospheres can be used in these plates to facilitate the generation of standardized neurosphere-spheroids
Stripettes (serological pipettes, sterile, 5ml and 10 ml)	various e.g. Costar	CLS4488-50; CLS4487-50	for tissue culture and collagen preparation
various multichannel (50 – 250 uL) and single channel pipettes (10 uL, 50 uL, 200 uL 1 mL)	various	various	for cell and spheroid handling
Widefield microscopy	various	various	for observation of spheroid generation and spheroid imaging; here wide-field fluorescence images were captured using an EVOS FL cell imaging system (Thermo Fisher Scientific)
Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective	Zeiss	quote from manufacturer	Confocal images were captured using a Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective. Diode 405nm, 458/488/514 nm argon multiline and HeNe 594nm lasers were used to excite Phalloidin 594, Alexa Fluor 488, and DAPI respectively. For each image a single representative optical section were captured, with all settings, both pre- and post-image capture, maintained for comparative purposes. All images were subsequently processed using the associated Zen imaging software and Adobe Photoshop.