Karakterisering van de effecten van migraine remmers op de invasie van 3D-tumor Spheroid door confocale microscopie met hoge resolutie

Summary

De effecten van migraine remmers op glioom kanker Celmigratie in driedimensionale (3D) invasie testen met behulp van een histon deacetylase (HDAC) inhibitor worden gekenmerkt door een hoge resolutie confocale microscopie.

Abstract

Het opsporen en ontwikkelen van geneesmiddelen in kankeronderzoek wordt steeds meer gebaseerd op medicijn schermen in 3D-formaat. Nieuwe remmers gericht op het migratie-en invasief potentieel van kankercellen, en bijgevolg de gemetastaseerde verspreiding van ziekten, worden ontdekt en beschouwd als complementaire behandelingen in zeer invasieve kankers zoals gliomas. Dus, het genereren van gegevens waardoor de gedetailleerde analyses van cellen in een 3D-omgeving na de toevoeging van een medicijn is vereist. De hier beschreven methodologie, het combineren van spheroid invasie testen met hoge resolutie beeldopname en data-analyse door confocale laser scanning microscopie (CLSM), ingeschakeld gedetailleerde karakterisering van de effecten van de potentiële anti-migratie remmer MI-192 op glioom cellen. Spheroids werden gegenereerd uit cellijnen voor invasie testen in laagaanhandig 96-goed platen en vervolgens voorbereid voor CLSM-analyse. De beschreven workflow had de voorkeur boven andere veelgebruikte spheroid-genererende technieken vanwege zowel gemak als reproduceerbaarheid. Dit, in combinatie met de verbeterde beeldresolutie bereikt door confocale microscopie in vergelijking met conventionele breedveld benaderingen, liet de identificatie en analyse toe van verschillende morfologische veranderingen in migratie cellen in een 3D-omgeving na behandeling met de migrastatic drug MI-192.

Introduction

Driedimensionale spheroid-technologieën voor preklinische geneesmiddelen ontdekking en de ontwikkeling van potentiële kankergeneesmiddelen worden in toenemende mate begunstigd op conventionele drugs schermen; Er is dus meer ontwikkeling van migraine — migratie en invasie voorkomen — drugs. De achterliggende gedachte achter deze ontwikkelingen in de behandeling van kanker is duidelijk: 3D-spheroid-assays vormen een realistischer benadering voor het screenen van potentiële anti-kanker drugs, omdat ze de 3D-tumor architectuur meer getrouw nabootsen dan de monolaag-culturen van cellen, even drug-tumor interacties (kinetiek) nauwkeuriger, en toestaan de karakterisering van drug activiteit in een tumor-gerelateerde setting. Bovendien is de opkomst van resistentie tegen chemotoxische geneesmiddelen in vele soorten kanker en hoge sterftecijfers onder kankerpatiënten als gevolg van metastasen versterkt door het vermogen van kankercellen te migreren naar verre tumor sites ondersteunt de opname van chemotherapeutische agenten gericht op het migratie potentieel van kankercellen als adjuvante behandeling in toekomstige klinische kanker onderzoeken¹. Dit is met name het geval bij zeer invasieve kankers, zoals high-grade glioblastomas (GBM). GBM-beheer omvat chirurgie, radiotherapie en chemotherapie. Echter, zelfs met combinatiebehandeling, de meeste patiënten recidief binnen 1 jaar van de initiële diagnose met een mediane overleving van 11-15 maanden^2,3. Er zijn de afgelopen jaren enorme vooruitgang geboekt op het gebied van 3D-technologie: rotatieve systemen, micro fabricaat structuren en 3D-steigers, en andere individuele testen worden voortdurend verbeterd om routinematige tests op grote schaal⁴mogelijk te maken^{, 5,6,7}. De resultaten van deze testen moeten echter op een zinvolle manier worden geanalyseerd, omdat gegevens interpretatie vaak wordt belemmerd door pogingen om 3D-gegenereerde gegevens te analyseren met 2D-beeldanalyse systemen.

Ondanks de voorkeur in termen van beeld acquisitie snelheid en verminderde foto-toxiciteit, blijven de meeste breedveldsystemen beperkt door resolutie⁸. Zo, afgezien van de gegevens lezen-outs met betrekking tot de werkzaamheid van het geneesmiddel, gedetailleerde effecten van drug actie op 3D cellulaire structuren van migrerende cellen zijn onvermijdelijk verloren als afbeelding gemaakt met behulp van een breed-veld systeem. Omgekeerd, confocale laser scanning microscopie (CLSM) vangt hoge kwaliteit, optisch verdeelde beelden die kunnen worden gereconstrueerd en gerenderd in 3D na overname met behulp van computer software. CLSM is dus gemakkelijk toepasbaar op Imaging complexe 3D cellulaire structuren, waardoor ondervraging van de effecten van anti-migrastatic remmers op 3D structuren en diepgaande analyses van de cel migratie mechanismen. Dit zal ongetwijfeld leiden tot toekomstige migrastatic drug ontwikkeling. Hier wordt een gecombineerde workflow van spheroid-generatie, medicamenteuze behandeling, kleurings protocol en karakterisering door confocale microscopie met hoge resolutie beschreven.

Protocol

1. generatie van Celsferioïden Dag 1 Bereid het standaard kweekmedium voor zoals vereist door de onderzochte cellijn. Voer alle met weefselkweek samenhangende stappen uit in een weefselkweek afzuigkap met behulp van steriele behandelingstechnieken. Trypsinize en Tel kankercellen. Gebruik 20 mL celsuspensie per plaat. Houd de celsuspensies in duidelijk gelabelde steriele universele buizen. Voeg een vooraf bepaald aantal cellen toe aan el…

Representative Results

Driedimensionale spheroid-technologie vordert het begrip van interacties tussen geneesmiddelen en tumoren, omdat het meer representatief is voor de kankerspecifieke omgeving. De generatie van sferoïden kan op verschillende manieren worden bereikt; lage hechting 96-put platen werden gebruikt in dit protocol. Na het testen van verschillende producten van verschillende fabrikanten, werden de hier gebruikte platen gekozen omdat ze consequent het beste presteerden in termen van succesvolle sp…

Discussion

Een nieuwe manier om kankercel sferoïden te maken voor de identificatie van de activiteit van migraine met behulp van hoge-resolutie confocale microscopie wordt beschreven. Het gebruik van lage hecht platen over andere technieken, zoals hangende druppels¹⁵, heeft een middel vergemakkelijkt om reproduceerbare en uniforme sferioïden te genereren voor gebruik in de collageen migratie en invasie testen. De kritische punten in dit protocol zijn de verwijdering van het groeimedium van de 96-put voor d…

Materials

Collagen I, rat tail, 100 mg	Corning	354236	for glioma invasion assay; this is offered by many distributors/manufacturers and will need to be determined for both the type of assay intended and cell lines used. For glioma cancer cell lines Collagen rat tail type 1 ( e.g. Corning) is the preferred choice. Collagen should be stored at 4oC, in the dark, until required. It is not advisable to mix collagen from different batches as this may affect the consistency of the polymerized collagen.
Coverslips	various	various	for microscopy imaging
DMEM powder	Sigma	D5648	needed at 5X concentration for collagen solution for glioma invasion assay;  this may be purchased in powdered form, made up in double distilled water and, depending upon final composition of the growth medium, completed with any additives required. The complete 5X solution should be filtered through a syringe filter system (0.22 microns) before use.
Foetal calf serum	Sigma	F7524-500ML	needed for cell culture of glioma cell lines
Glass slides	various	various	for microscopy imaging
High glucose DMEM	Gibco	41965062	needed for cell culture of glioma cell lines
Inhibitor	Tocris	various	various – according to experimental design; inhibitors can be purchased from manufacturers such as Selleckchem and Tocris. These manufacturers offer detailed description of inhibitor characteristics, links to associated references and suggestion of working concentrations. As with all inhibitors, they may be potentially toxic and should be handled according to health and safety guidelines. Inhibitors are prepared as stock solutions as recommended by the manufacturer. As an example we used the migrastatic inhibitor MI-192 to demonstrate the use of such inhibitors. We have tested a range of migrastatic inhibitors in this way with comparable results.
Mountant	various	various	for microscopic imaging
NaOH (1 M)	various	various	NaOH can be either purchased at the required molarity or prepared from solid form. The prepared solution should be filter sterilized using a syringe filter system. One M NaOH is corrosive and care should be taken during solution preparation.
Paraformaldehyde	various	various	for fixing spheroids and cells; make up at 4%, caution health hazard, ensure that health and safety regulations are adhered to for collagen solution for invasion assay
Pastettes (graduated pipette, 3ml)	various	various	for invasion assay, solution removal
PBS, sterile for tissue culture	Sigma	D1408-500ML	needed for cell culture of glioma cell lines and washes for staining
Pen/strep (antibiotics)	Sigma	P4333	needed for cell culture of glioma cell lines
Primary antibody, secondary antibody, DAPI, Phalloidin	various	various	there are many manufacturers for these reagents, for secondary labelled antibodies we recommend Alexa Fluor (Molecular Probes). Here we used for primary antibodies mouse anti-acetylated tubulin antibody (1/100, Abcam). For secondary antibodies we used 1/500 anti-mouse Alexa Fluor 488 conjugated antibody, Molecular Probes. For nuclear stain we used DAPI (many manufacturers) and the actin stain Phalloidin (many manufacturers) both used at recommended dilution of 1/500.
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761	needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5X concentration
Sodium pyruvate	Sigma	P5280	needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5X concentration
Trypsin	Sigma	T4049	for trypsinisation
Ultra low attachment plates	Sigma/Nunc	CLS7007-24EA	for glioma invasion assay; a low adherent plate is required, with 96-well plates preferred to allow for large-scale screening of compounds under investigation. There are several low adherence plates commercially available; it is advisable to test a variety of plates for optimum spheroid generation. In our experience Costar Ultra Low Cluster with lid, round bottom, works best for the generation of spheroids from glioma cancer cells in terms of 100% spheroid formation and reproducibility. These plates were also successfully used for the generation of glioma spheroids from patient-derived material, bladder and ovarian cancer cells in our laboratory. In addition, stem or progenitor neurospheres can be used in these plates to facilitate the generation of standardized neurosphere-spheroids
Stripettes (serological pipettes, sterile, 5ml and 10 ml)	various e.g. Costar	CLS4488-50; CLS4487-50	for tissue culture and collagen preparation
various multichannel (50 – 250 uL) and single channel pipettes (10 uL, 50 uL, 200 uL 1 mL)	various	various	for cell and spheroid handling
Widefield microscopy	various	various	for observation of spheroid generation and spheroid imaging; here wide-field fluorescence images were captured using an EVOS FL cell imaging system (Thermo Fisher Scientific)
Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective	Zeiss	quote from manufacturer	Confocal images were captured using a Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective. Diode 405nm, 458/488/514 nm argon multiline and HeNe 594nm lasers were used to excite Phalloidin 594, Alexa Fluor 488, and DAPI respectively. For each image a single representative optical section were captured, with all settings, both pre- and post-image capture, maintained for comparative purposes. All images were subsequently processed using the associated Zen imaging software and Adobe Photoshop.