उच्च संकल्प Confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा 3 डी ट्यूमर स्फीरॉइड आक्रमण पर Migrastatic inhibitors के प्रभाव का चरित्र

Summary

तीन आयामी (3 डी) आक्रमण पर ग्लियोमा कैंसर सेल प्रवास पर migrastatic inhibitors के प्रभाव एक हिस्टोन deacetylase (HDAC) अवरोध करनेवाला का उपयोग कर उच्च संकल्प confocal माइक्रोस्कोपी की विशेषता है.

Abstract

दवा खोज और कैंसर अनुसंधान में विकास तेजी से एक 3 डी प्रारूप में दवा स्क्रीन पर आधारित किया जा रहा है. कैंसर कोशिकाओं के प्रवासी और आक्रामक क्षमता को लक्षित उपन्यास अवरोधकों, और फलस्वरूप रोग के मेटास्टैटिक प्रसार, की खोज की जा रही है और इस तरह के ग्लियोमास के रूप में अत्यधिक इनवेसिव कैंसर में पूरक उपचार के रूप में माना जाता है। इस प्रकार, एक दवा के अलावा के बाद एक 3 डी वातावरण में कोशिकाओं की विस्तृत विश्लेषण को सक्षम करने के लिए डेटा पैदा करने की आवश्यकता है. यहाँ वर्णित पद्धति, उच्च संकल्प छवि पर कब्जा और confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (CLSM) द्वारा डेटा विश्लेषण के साथ spheroid आक्रमण assays के संयोजन, संभावित विरोधी प्रवासी निरोधक के प्रभाव का विस्तृत लक्षण सक्षम ग्लियोमा कोशिकाओं पर MI-192. स्फ़रॉइड्स कम अनुयायी 96-वेल प्लेट्स में आक्रमण परख के लिए सेल लाइनों से उत्पन्न किए गए थे और फिर सीएलएसएम विश्लेषण के लिए तैयार किए गए थे। वर्णित कार्यप्रवाह को आसानी और पुनरुत्पादनीयता दोनों के कारण अन्य सामान्य रूप से उपयोग किए जाने वाले गोलभ-उत्पादक तकनीकों पर पसंद किया गया था. यह, पारंपरिक व्यापक क्षेत्र दृष्टिकोण की तुलना में confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त बढ़ाया छवि संकल्प के साथ संयुक्त, पहचान और एक 3 डी वातावरण में प्रवासी कोशिकाओं में अलग रूपात्मक परिवर्तन के विश्लेषण की अनुमति दी निम्नलिखित Migrastatic दवा एमआई-192 के साथ उपचार.

Introduction

पूर्व नैदानिक दवा की खोज और संभावित कैंसर दवाओं के विकास के लिए तीन आयामी गोलभॉइड प्रौद्योगिकियों तेजी से पारंपरिक दवा स्क्रीन पर इष्ट किया जा रहा है; इस प्रकार, वहाँ migrastatic के अधिक विकास है – प्रवास और आक्रमण को रोकने – दवाओं. कैंसर के इलाज में इन घटनाओं के पीछे तर्क स्पष्ट कर रहे हैं: 3 डी spheroid परख संभावित विरोधी कैंसर दवाओं स्क्रीनिंग के लिए एक और अधिक यथार्थवादी दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व के रूप में वे 3 डी ट्यूमर वास्तुकला की नकल अधिक ईमानदारी से सेल monolayer संस्कृतियों से, दवा ट्यूमर बातचीत (kinetics) अधिक सही recapitulate, और एक ट्यूमर से संबंधित सेटिंग में दवा गतिविधि की विशेषता की अनुमति देते हैं. इसके अलावा, कई कैंसर प्रकार और कैंसर कोशिकाओं की क्षमता से कैंसर कोशिकाओं की क्षमता से शक्तिशाली के कारण कैंसर रोगियों के बीच उच्च मृत्यु दर में chemotoxic दवाओं के लिए प्रतिरोध की वृद्धि दूर ट्यूमर साइटों के लिए स्थानांतरित करने के लिए chemothetic एजेंटों के शामिल किए जाने का समर्थन करता है भविष्य के नैदानिक कैंसर परीक्षणों में सहायक उपचार के रूप में कैंसर कोशिकाओं की प्रवासी क्षमता को लक्षित^{करना 1}. यह विशेष रूप से अत्यधिक आक्रामक कैंसर में मामला है, जैसे उच्च ग्रेड ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम)। जीबीएम प्रबंधन सर्जरी, रेडियोथेरेपी, और कीमोथेरेपी भी शामिल है। हालांकि, यहां तक कि संयोजन उपचार के साथ, ज्यादातर रोगियों को 11-15 महीने^2,3की एक औसत अस्तित्व के साथ प्रारंभिक निदान के 1 साल के भीतर पतन। 3 डी प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में भारी अग्रिम पिछले कुछ वर्षों में किया गया है: rotative सिस्टम, microfabricated संरचनाओं और 3 डी पाड़, और अन्य व्यक्तिगत परख लगातार एक बड़े पैमाने पर नियमित परीक्षण की अनुमति के लिए सुधार किया जा रहा है^{4, 5,6,7}. हालांकि, इन परख से प्राप्त परिणामों का विश्लेषण एक सार्थक तरीके से किया जाना चाहिए क्योंकि डेटा व्याख्या अक्सर 2 डी छवि विश्लेषण प्रणालियों के साथ 3 डी जनित डेटा का विश्लेषण करने के प्रयासों से बाधित होती है।

छवि अधिग्रहण की गति और कम फोटो विषाक् तता के मामले में बेहतर होने के बावजूद, सबसे व्यापक क्षेत्र प्रणाली^{संकल्प 8}द्वारा सीमित रहते हैं। इस प्रकार, दवा प्रभावकारिता से संबंधित डेटा पठन-आउट के अलावा, पलायन कोशिकाओं के 3 डी सेलुलर संरचनाओं पर दवा कार्रवाई के विस्तृत प्रभाव अनिवार्य रूप से खो रहे हैं अगर एक व्यापक क्षेत्र प्रणाली का उपयोग कर छवि. इसके विपरीत, confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (CLSM) उच्च गुणवत्ता, ऑप्टिकली अनुभाग छवियों कि पुनर्निर्माण किया जा सकता है और 3 डी के बाद अधिग्रहण में प्रदान कंप्यूटर सॉफ्टवेयर का उपयोग कर कब्जा. इस प्रकार, सीएलएसएम आसानी से इमेजिंग जटिल 3 डी सेलुलर संरचनाओं के लिए लागू है, जिससे 3 डी संरचनाओं पर विरोधी migrastatic inhibitors के प्रभाव और सेल प्रवास तंत्र के गहन विश्लेषण के पूछताछ को सक्षम करने. यह निस्संदेह भविष्य migrastatic दवा विकास मार्गदर्शन करेंगे. यहाँ, गोलभद्योग पीढ़ी, दवा उपचार, धुंधला प्रोटोकॉल, और उच्च संकल्प confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा विशेषता का एक संयुक्त कार्यप्रवाह वर्णित है.

Protocol

1. सेल स्फीरॉइड्स का उत्पादन 1 दिन जांच के तहत सेल लाइन द्वारा आवश्यक के रूप में मानक संस्कृति माध्यम तैयार करें। बाँझ हैंडलिंग तकनीक का उपयोग कर एक ऊतक संस्कृति हुड में सभी ऊतक स…

Representative Results

तीन आयामी गोलभॉइड प्रौद्योगिकी दवा ट्यूमर बातचीत की समझ को आगे बढ़ा रही है क्योंकि यह कैंसर विशेष वातावरण के अधिक प्रतिनिधि है. गोलभों की पीढ़ी को कई तरीकों से प्राप्त किया जा सकता है; इस प?…

Discussion

उच्च संकल्प confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर migrastatic दवा गतिविधि की पहचान के लिए कैंसर सेल स्फीरोइड बनाने के लिए एक उपन्यास तरीका वर्णित है. अन्य तकनीकों पर कम अनुलग्न प्लेटों के उपयोग, जैसे फांसी बूँदें<sup class=…

Materials

Collagen I, rat tail, 100 mg	Corning	354236	for glioma invasion assay; this is offered by many distributors/manufacturers and will need to be determined for both the type of assay intended and cell lines used. For glioma cancer cell lines Collagen rat tail type 1 ( e.g. Corning) is the preferred choice. Collagen should be stored at 4oC, in the dark, until required. It is not advisable to mix collagen from different batches as this may affect the consistency of the polymerized collagen.
Coverslips	various	various	for microscopy imaging
DMEM powder	Sigma	D5648	needed at 5X concentration for collagen solution for glioma invasion assay;  this may be purchased in powdered form, made up in double distilled water and, depending upon final composition of the growth medium, completed with any additives required. The complete 5X solution should be filtered through a syringe filter system (0.22 microns) before use.
Foetal calf serum	Sigma	F7524-500ML	needed for cell culture of glioma cell lines
Glass slides	various	various	for microscopy imaging
High glucose DMEM	Gibco	41965062	needed for cell culture of glioma cell lines
Inhibitor	Tocris	various	various – according to experimental design; inhibitors can be purchased from manufacturers such as Selleckchem and Tocris. These manufacturers offer detailed description of inhibitor characteristics, links to associated references and suggestion of working concentrations. As with all inhibitors, they may be potentially toxic and should be handled according to health and safety guidelines. Inhibitors are prepared as stock solutions as recommended by the manufacturer. As an example we used the migrastatic inhibitor MI-192 to demonstrate the use of such inhibitors. We have tested a range of migrastatic inhibitors in this way with comparable results.
Mountant	various	various	for microscopic imaging
NaOH (1 M)	various	various	NaOH can be either purchased at the required molarity or prepared from solid form. The prepared solution should be filter sterilized using a syringe filter system. One M NaOH is corrosive and care should be taken during solution preparation.
Paraformaldehyde	various	various	for fixing spheroids and cells; make up at 4%, caution health hazard, ensure that health and safety regulations are adhered to for collagen solution for invasion assay
Pastettes (graduated pipette, 3ml)	various	various	for invasion assay, solution removal
PBS, sterile for tissue culture	Sigma	D1408-500ML	needed for cell culture of glioma cell lines and washes for staining
Pen/strep (antibiotics)	Sigma	P4333	needed for cell culture of glioma cell lines
Primary antibody, secondary antibody, DAPI, Phalloidin	various	various	there are many manufacturers for these reagents, for secondary labelled antibodies we recommend Alexa Fluor (Molecular Probes). Here we used for primary antibodies mouse anti-acetylated tubulin antibody (1/100, Abcam). For secondary antibodies we used 1/500 anti-mouse Alexa Fluor 488 conjugated antibody, Molecular Probes. For nuclear stain we used DAPI (many manufacturers) and the actin stain Phalloidin (many manufacturers) both used at recommended dilution of 1/500.
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761	needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5X concentration
Sodium pyruvate	Sigma	P5280	needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5X concentration
Trypsin	Sigma	T4049	for trypsinisation
Ultra low attachment plates	Sigma/Nunc	CLS7007-24EA	for glioma invasion assay; a low adherent plate is required, with 96-well plates preferred to allow for large-scale screening of compounds under investigation. There are several low adherence plates commercially available; it is advisable to test a variety of plates for optimum spheroid generation. In our experience Costar Ultra Low Cluster with lid, round bottom, works best for the generation of spheroids from glioma cancer cells in terms of 100% spheroid formation and reproducibility. These plates were also successfully used for the generation of glioma spheroids from patient-derived material, bladder and ovarian cancer cells in our laboratory. In addition, stem or progenitor neurospheres can be used in these plates to facilitate the generation of standardized neurosphere-spheroids
Stripettes (serological pipettes, sterile, 5ml and 10 ml)	various e.g. Costar	CLS4488-50; CLS4487-50	for tissue culture and collagen preparation
various multichannel (50 – 250 uL) and single channel pipettes (10 uL, 50 uL, 200 uL 1 mL)	various	various	for cell and spheroid handling
Widefield microscopy	various	various	for observation of spheroid generation and spheroid imaging; here wide-field fluorescence images were captured using an EVOS FL cell imaging system (Thermo Fisher Scientific)
Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective	Zeiss	quote from manufacturer	Confocal images were captured using a Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective. Diode 405nm, 458/488/514 nm argon multiline and HeNe 594nm lasers were used to excite Phalloidin 594, Alexa Fluor 488, and DAPI respectively. For each image a single representative optical section were captured, with all settings, both pre- and post-image capture, maintained for comparative purposes. All images were subsequently processed using the associated Zen imaging software and Adobe Photoshop.