Summary
このプロトコルで提示される共培養相互作用アッセイは、安価で高いスループットとシンプルです。これらのアッセイは、共培養における微生物相互作用を観察し、相互作用パターンを同定し、ヒトおよび環境病原体に対する関心のある微生物株の阻害可能性を特徴付けるために使用することができる。
Abstract
微生物同士の相互作用の研究は、新しい抗菌薬から微生物生態学の洞察まで、数多くの発見につながっています。微生物相互作用の研究に使用される多くのアプローチは、特殊な機器を必要とし、高価で時間の多い。本論文では、安価で、大きなサンプル数にスケーラブルで、多数の実験計画に容易に適応できる共培養相互作用アッセイのプロトコルを提示する。微生物は一緒に培養され、それぞれが微生物の1対ごとの組み合わせを表す。試験生物は、各井戸の片側で培養され、最初に単一培養でインキュベートされる。その後、標的生物は、3Dプリントされた接種スタンプを使用して、各井戸の反対側に同時に接種される。共培養後、完成したアッセイは、成長または阻害などの視覚表現型についてスコア付けされます。これらのアッセイは、表現型を確認したり、目的の単離物間のパターンを同定するために使用することができます。この簡単で効果的な方法を使用して、ユーザーは微生物の組み合わせを迅速かつ効率的に分析することができます。この共培養アプローチは、抗生物質の発見と培養性マイクロバイオーム研究に適用可能であり、すでに両方の用途に応用されています。
Introduction
自然界では、微生物が単独で存在することはめったにない。その結果、彼らは常に他の生物と相互作用しています。したがって、微生物同士の相互作用を研究することは、多数の微生物挙動を理解するために不可欠である1.微生物相互作用は、相互主義的、共生的、または敵対的である可能性があります。これらのテラクションは、微生物自体だけでなく、微生物が1、2を植民地化する環境や宿主にも影響を与える可能性があります。
多くの科学者は、新しい抗菌分子を同定するために微生物相互作用を研究しています。最初の臨床的に重要な抗菌分子の1つは、微生物相互作用の研究を通じて見出された。サー・アレクサンダー・フレミングは、ブドウ球菌株の増殖を阻害する汚染ペニシリウム菌株を観察し、一般的に使用される抗生物質ペニシリン3の発見につながった。微生物が競合他社に敵対するために使用するメカニズムの特性は、抗菌分子の発見のための実りある資源のままです。例えば、最近、ストレプトマイセスsp.株Mg1が抗生物質リアーミシンを産生し、バチルス亜チリス4に対して溶解および分解活性を有することが示された。
さらに、ラグドゥニンという名前の非リボソマ的に合成されたペプチドは、最近、鼻の共生黄色ブドウ球菌ラグデネンシスが黄色ブドウ球菌5を阻害することを観察した後に発見された。研究はまた、微生物間の相互的相互作用が抗菌分子の発見のための拮抗相互作用と同じくらい強力であることを示しています。例えば、部族アッティーニ港の多くの真菌養殖アリは、彼らの真菌作物6の義務病原体を阻害する抗真菌分子を産生する外骨格上のシュードノカルディアと呼ばれる共生細菌を持っています。微生物相互作用の研究は抗菌分子の発見に有益であったので、高スループットスクリーンの使用は、新しい抗菌分子の発見をもたらす可能性があります。
コストとパフォーマンスの容易さに関しては、微生物相互作用を研究するために使用される方法論は、単純なものから複雑なものまで多い。例えば、寒天プラグアッセイは、複数の微生物間の拮抗作用7を調べるために使用することができる安価で簡単な方法である。しかし、寒天プラグアッセイは効率的な手順ではなく、多くのペアワイズの組み合わせに対して労働集約的な場合があります。高スループット方評による対象単離物に対する微生物生成製品の影響を評価するために、多くの研究室ではディスク拡散アッセイ8を使用しています。これらのアッセイは簡単で安価であり、より多くのサンプル7にスケーラブルにすることができます。しかし、このアッセイは微生物抽出物の生成を必要とし、サルモネラ菌およびセファロスポリン9などの標的生物および抗生物質の特定の組み合わせに対して誤解を招く結果を生じる可能性がある。
上記のアプローチは、微生物が相互に相互作用することを可能にするのではなく、標的生物で応答を引き出すために分離された成分に依存しています。これは、微生物間の相互作用が単培養では生成されない「不可解な」抗菌分子の産生を引き起こす可能性があるためです。例えば、抗菌性キーイシンは、同じスポンジマイクロバイオーム10から単離されたロドコッカスsp.と共培養した場合にのみ、マイクロモノスポラspによって産生されることが最近示された。より複雑な相互作用の方法論は、この潜在的な単一培養の障害を回避する。例えば、iChipは、環境サンプルから細菌を培養するのが困難な希少かつ困難な分離に有用であり、その現場11における増殖を通じて微生物相互作用の観察を可能にする。相互作用を詳細に調べるには、マトリックスアシストレーザー脱着/イオン化飛行時間イメージング質量分析(MALDI-TOF-IMS)を使用することができます。このアプローチは、高い空間分解能を有する微生物コロニーとの相互作用によって生成される小分子およびペプチドの組成および分布に関する詳細な情報を提供する。MALDI-TOF-IMSはまた、競争12、13、14、15のメカニズムを特徴付けるために細菌相互作用の複数の研究で使用されている。しかし、MALDI-TOF-IMSは、多くの場合、手間のかかるサンプル調製、機器を操作するための専門的な専門知識、および高価で特殊な質量分析計を必要とします。これらの理由から、高スループットスタディに使用するのは困難な手法です。したがって、上記のアプローチの多くの制限を克服する微生物相互作用のためのシンプルでスケーラブルで高スループットの共培養アッセイが有益であろう。
ここでは、高スループット微生物共培養のためのプロトコルが提示される。このアッセイは、単純かつ容易に微生物相互作用の既存の研究に組み込まれています。微生物相互作用の研究に一般的に使用される多くの方法とは対照的に、我々の方法は、シンプルで安価であり、多数の相互作用を調査するのに適しています。これらのアッセイは、実行が容易であるだけでなく、材料は、ほとんどの実験室のサプライヤーや公共のリソース(例えば、図書館やメーカースペース)から広く利用可能です。したがって、このアッセイは、微生物の多くのペアワイズの組み合わせの間で興味深いパターンを同定し、解析するための調査の第一線として有利であり、微生物生態学の調査に特に有用であり得る。
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Protocol
インフォームドコンセントはドナーの両親から得られ、ウィスコンシン大学マディソン校のヒト被験者委員会は研究を承認しました(機関審査委員会[IRB]承認番号H-2013-1044)。
1. サンプル培養
注:この手順は、ヒトの鼻腔から分離した細菌間の相互作用の研究のためにここで使用される。原則として、以下の方法は、任意の培養条件に適用可能である。脳心注入ブロス(BHI)は、鼻細菌の一般的な伝播に使用されます。すべてのプレートは1.5%寒天を使用して固化されます。本研究では、ドナーの鼻に洗い流された生理液(鼻洗浄)からサンプルを採取し、マイクロ遠心管に移し、-80°Cで凍結する。
- 標準的な培養技術を使用して、各解凍洗浄サンプルの100 μLをBHIプレートにプレートします。
- プレートを37°Cで1週間好気的にインキュベートします。
- インキュベーション後、プレートごとに各異なる形態の≥2コロニーを選択し、最初のプレートから新しいBHIプレートにコロニーをストリークし、37°Cでプレートをインキュベートすることにより、BHIプレート上で好気的に分離します。細菌培養物が純粋になるまで繰り返します。
注:細菌単離物は、コロニー形態、グラム染色、16S rRNA遺伝子シーケンシング、または別の方法を介して同定することができる。ただし、プロトコルを続行するために分離された ID を知ることは必要ありません。 - クライオチューブ内の細菌一晩培養(セクション3参照)と50%グリセロールの1 mLを組み合わせた後、-80°Cですべての細菌単離物を凍結保存します。
2. 3Dプリントスタンプ
注:ポリカーボネートは、標準的なオートクレーブ温度(121°C)を超える高いガラス転移温度(147°C)により、繰り返し使用後の変形の可能性を最小限に抑えるスタンピング材料として選定されました。
- ポリカーボネートフィラメントで3Dプリンタをロードします。
- ホワイトスクールの接着剤(アセテートポリビニル)をプリントベッドに塗布し、密着性を高め、印刷中の接種スタンプの歪みを最小限に抑えます。
- を読み込みます。3Dプリンターソフトウェアへの接種スタンプ(図1)のSTLモデルファイル(補足データファイル)。
- 接種スタンプを290°Cノズル温度、60°Cのベッド温度、層の高さが0.38mmで印刷します。
- アルミホイルにスタンプを巻き、15分間の乾燥で重力サイクルで1.5時間オートクレーブで殺菌します。
注:ポリカーボネートは吸湿性ですが、切手はオートクレーブ後に約0.5%の水重しか保持し続け、その重量は約0.5%しか保持しなくなっています。
3. 一晩文化の準備
- 血清ピペットを使用して、14 mL培養チューブに無菌BHIスープのピペット3 mL。
- 無菌1μL接種ループを用いて、細菌コロニーをブロスに接種する。ループを旋回して、塊がスープに分散していることを確認します。培養チューブをインキュベーションの前に短時間渦にする。
- 250 rpmでシェーカーで一晩37°C(〜16 h)で培養管をインキュベートします。
- 細菌培養物が十分な濁度(OD600≥1)に達すると細胞の塊を分解する渦。
4. バイオアッセイプレートの調製
注:バイオアッセイプレートは、無菌性を維持するために層流フードで調製されます。
- 1.5%寒天でBHIメディアを準備し、メーカーの指示に従ってオートクレーブで殺菌します。
- オートクレーブ後、BHI媒体を温度管理された水浴で55°Cに冷却します。
- 血清ピペットを用いて、12ウェルプレート上の12ウェルのそれぞれに溶融BHI培地のピペット3mLを使用する。井戸ができるだけ正確で、可能な限りであることを確認してください。1リットルの培養物は、約27枚のバイオアッセイプレートを生成します。
- 寒天を一晩設定します。
5. 試験生物を用いるバイオアッセイプレートの接種
注:試験生物は、阻害活性の産生(例えば、抗生物質産生)が共培養相互作用アッセイを用いて決定される生物をいう。この実験では、試験生物は鼻洗浄サンプルから単離されたアクチノバクテリアである。
- 試験生物をバイオアッセイプレート上で接種するには、無菌の10μL接種ループを一晩培養に挿入し、プレートの左3分の1に培養液滴をよく取り付けます。
注:井戸の過剰増殖は、後の標的生物の接種を禁止するように、井戸の3分の1だけをストリークすることをお勧めします。 - プレート上のすべての12ウェルが試験生物に接種されるまで繰り返します。
- プレートを適当な温度で7日間逆さまにインキュベートします。より高い温度(≥37°C)または乾燥した気候では、プレートが乾燥するのを防ぐために湿った容器にプレートを保管してください。
6. 標的生物の調製
注:標的生物とは、共培養相互作用アッセイを用いて阻害状態が決定される生物をいう。この実験では、標的生物は鼻洗浄サンプルから単離されたブドウ球菌菌である。
- バイオアッセイプレートを6日間インキュベートした後、上記のように指定された標的生物の一晩培養物を調記する(セクション3参照)。
7. 対象生物接種
注:一晩インキュベーションの後、培養物が濁っていることを確認してください(OD600 ≥ 1)。いくつかの細菌培養物は、培養管の底部に凝集することがある。培養管を渦にして塊を分散させ、培養濁度を評価する。
- 空の12ウェルプレートの各ウェルを1.8mLのBHIと200μLの標的一晩培養で充填してターゲットプレートを調べます。
- 包みを外し、無菌接種スタンプをターゲットプレートに入れます。穏やかに井戸の周りの文化を旋回, 文化が近隣の井戸を汚染しないように注意してください.
- 接種スタンプを持ち上げ、各スタンプ先端に希釈されたターゲット培養の液滴があることを確認します。
-
接種されていないバイオアッセイプレートに接種スタンプを置き、培養ドロップが各井戸に接種するようにスタンプを静かに揺らして、単培養制御プレートを準備します。接種スタンプが除去されると、バイオアッセイプレートの井戸に培養液滴が見えるはずです。
- 培地の不均一なレベルに起因する接種スタンプを接種していない場合は、ピペットを使用して井戸の右側に希釈された一晩培養物の3 μLを見つける。
- 上記のようにバイオアッセイプレートを接種します(ステップ7.4.1を参照)が、先端が12ウェルプレートの右側に揃うようにスタンプを揃えます。ウェルを接種する際に、スタンプが既存の細菌コロニーに接触しないことを確認します。
- スタンプを慎重に取り外し、ターゲットプレートに戻します。
- すべてのプレートが接種されるまで、各バイオアッセイプレートの接種を繰り返します。
- バイオアッセイプレートを適正な温度で7日間逆さまにインキュベートします。
8. 得点
-
1週間の試験と標的生物を共培養した後、次の視覚評価に基づいて相互作用をスコアリングします。
- 単一培養対照と区別できない成長を示す標的生物の成長を「0」(阻害なし)としてウェルをスコア付けする(図2A,B)。
- 「1」(弱い阻害)として対照と比較して成長の減少を示す標的生物を持つウェルをスコア付けする(図2C)。
- 標的生物が「2」(強い阻害)として成長しなかったウェルをスコア付けする(図2D)。
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Representative Results
共培養インタラクションアッセイは、微生物の相互作用を理解し、関心のあるパターンを特定し、興味深い活動を伴う微生物単離物を発見するために使用することができます。これらのアッセイでは、試験生物を12ウェル寒天板の片側に単培養し、7日間インキュベートする。続いて、標的生物が試験生物の隣に発見され、2匹の微生物を7日間共培養し、標的生物の成長表現型をスコアリングした。アッセイは、標的生物の増殖または阻害の視覚的分析に基づいてスコア付けされる。
これらの共培養アッセイは、最近、ヒト鼻腔から単離されたブドウ球菌(標的生物)に対するアクチノバクテリア(試験生物)の阻害活性を評価するために用いられた(図2)16。共培養アッセイは、アクチノバクテリア(n=21)とブドウ球菌単離物(n=39)の間の特定の阻害パターンを同定するために使用され、アクチノバクテリア単離物が凝固性陰性を阻害する能力にばらつきを示したことを示した。ブドウ球菌(CoNS)。合計812組の組み合わせが試験された。特に、コリネバクテリウム・プロピンクムはCoNSを強く阻害した(図2D)、特にCoNSを弱く阻害した他のコリネバクテリウム(図2C)と比較して、CoNS(図2C)に影響を及ぼさなかった(図2B、および単一培養制御(図2A)16と比較した。
比較ゲノミクスを用いて、他のコリネバクテリウム単離物16のゲノムに存在しなかったC.プロピンクムゲノムにおいて、サイドロフォア産生のための生合成遺伝子クラスターが同定された。サイドロフォアは、環境17から鉄を清掃するために微生物によって生成されるキレートです。C.プロピクウムによるサイドロフォア産生が確認され、サイドロフォアはデヒドロキシノカルダミン16と同定された。この結果は、CoNSの阻害がサイドロフォア媒介性鉄の枯渇によるものであるという仮説につながった。続いて、C.プロビンクムとCoNSとの間で標準および鉄補充BHI培地の両方で共培養相互作用アッセイを行うことにより、阻害表現型が鉄依存性であったと判定した(図2E)。これらの結果は、これらの結果は、サイドロフォア媒介性鉄枯渇がC.プロビンクウム16によるCoNSの強い阻害の原因であることを示唆した。
図1:バイオアッセイ接種スタンプの写真。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:共培養相互作用アッセイは、コリネバクテリウム・プロピンクムによるCoNSのサイドロフォア媒介阻害を明らかにする。(A)BHIバイオアッセイプレートに接種したCoNS(標的生物)の単培養。(B,C,D)コリネバクテリウム菌の異なる株(試験生物、左)とBHIバイオアッセイプレートに接種されたCoNS(標的生物、右)の同じ株との間の共培養。各パネルは、(B)阻害なし(スコア=0)、(C)弱い阻害(スコア=1)、または(D)強い阻害(スコア=2)との相互作用を示す代表的な画像である。(E)BHIメディア(BHI)とBHIメディア上のCONSの同じ株を持つコリネバクテリウム・シュードジフェリチカム(サイドロフォア非生産者)またはコリネバクテリウム・プロピンクウム(サイドロフォア・プロデューサー)との相互作用の比較200 μM FeCl3 (BHI + 鉄) を補充します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
微生物相互作用を媒理化する抗生物質およびその他の二次代謝産物は、創薬を含む多数のアプリケーションに有用である。本明細書では、多数の微生物相互作用を評価する共培養アッセイのためのプロトコルが提示される。これらの共培養インタラクションアッセイは、シンプルで手頃な価格、スケーラブル、および高スループットの手段で、多くの微生物の組み合わせを組み合わせて調べることができます。標的生物は接種スタンプを用いて12ウェルプレートの井戸内の試験生物の隣に発見され、標的生物の表現型の目視検査に基づいて標的生物の阻害が採点される。これらのアッセイで使用される材料の大半は、ほとんどの実験室のサプライヤーまたは公共資源を通じて容易に入手可能です。従って、アッセイは多くの実験室の環境に容易に合わせることができる。実験室では、これらの共培養アッセイは、様々な環境から多くの宿主に関連する微生物の相互作用を調査する上で成功している。
この手法には多くの利点がありますが、いくつかの制限もあります。第1の顕著な制限は、共培養アッセイのパターンは、他のメタデータなしでは解釈が困難であるということです。これらの共培養アッセイ16、18を用いた2つの最近の論文では、対象の阻害パターンは、試験生物の分類的アイデンティティなどの他のメタデータと共に同定された。それにもかかわらず、メタデータを伴わなくても、本論文で概説する方法は、特定の病原体または目的とする標的微生物に対する阻害活性を有する細菌単離物を同定するのに適している。
追加の制限は、これらのアッセイが市販されていない、およびバイオアッセイプレートが手で調製されなければならず、アッセイの効率を制限する可能性があることです。プレートの調製は実験に不可欠であり、プレートを準備する間は注意が必要です。井戸が不均一である場合、接種スタンプはすべての井戸を接種できない可能性があります。しかし、見逃された井戸は、標的生物培養物を各接種井戸の右側に直接配管することによって接種することができる。確かに、各プレート上のいくつかの井戸がスタンプによって欠落している場合でも、手順は、すべての単一の井戸に直接ターゲット生物を配管するよりも、まだ効率的です。あるいは、ユーザーは接種スタンプを見て、ターゲット生物を各井戸にピペットすることができますが、このプロセスは、特に12ウェルを同時にスタンプするのと比較して、より時間がかかります。
最後に、試験生物は、標的生物が接種される前に、単培養中にウェル内で利用可能な栄養素を消費する可能性があります。栄養の枯渇は観察された阻害パターンに影響を与えるかもしれないが,これまでにテストされたペアワイズの組み合わせの中では珍しいように見える。特に、C.プロビンクムによる井戸中の鉄の枯渇は、ヒト鼻微生物叢16のメンバーからのサイドロフォア媒介性競争の発見を可能にした。
これらの共培養相互作用アッセイは、培養物組成物、タイミング、または試験生物として複数の生物または微生物コンソーシアムを含むことさえによってカスタマイズ可能である。さらに、相互作用表現型を記述するために必要な詳細レベルに応じて、異なるスコアリングシステムを使用することができます。スコアリングスケールの例には、ヒト鼻腔16(図2)から単離された細菌間の競合相互作用を記述するために使用される0-2からのもの、およびストレプトマイセスの抗菌電位を評価するために使用される0-3からのものが含まれます。昆虫マイクロバイオーム18から分離された。しかし、より微妙なスケールでは、スコアリングはますます困難になります。したがって、阻害は、バイナリスコアリングシステムを使用して最も容易に認識される(例えば、0は阻害なしと定義され、1は阻害として定義される)、これは任意の混乱を排除し、複数の個体間でスコアリングを標準化することができる。さらに、阻害表現型のスコアリングに加えて、これらのアッセイは、顔料産生、胞子化、または視覚的に評価できる他の表現型を含む他の表現型についてもスコアリングすることができます。これらのアッセイは、ターゲット生物の目視検査に基づく分析で非常にスケーラブルなため、表現型スコアリングを容易にし、アッセイスループットをさらに向上させるために機械学習アルゴリズムのトレーニングセットを生成できます。
これらの共培養アッセイの主な強みは、多くのペアワイズ相互作用の多くの組み合わせを安価かつ迅速にスクリーニングし、目的の活動または阻害パターンを明らかにする能力である。その後、より複雑で集約的な方法(すなわち、ゲノム特性、MALDI-TOF-IMS、または天然物の単離および特性化)は、微生物および目的の相互作用のより深い特徴付けに使用されてもよい。共同培養アッセイ。最近の例として、これらの共培養阻害アッセイは、昆虫由来の連鎖菌が土壌由来のものよりもグラム陰性細菌および真菌をより優れた阻害できることを示すために用いられた。阻害アッセイは、2,003ストレプトマイセスの阻害パターンを迅速かつ効率的に可視化することができ、薬剤耐性真菌病原体に対して活性であるサイフォマイシンと呼ばれる新しい抗真菌剤の発見につながった18.したがって、これらの共培養相互作用アッセイは、微生物研究、抗菌発見、および微生物相互作用のパターンに関するより深い洞察を得るための強力なツールです。
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Disclosures
著者は、競合する利益を宣言しません。
Acknowledgments
原稿を批判的に読んでくれたダニエル・メイ、マーク・シェブレット、ドン・ホアンに感謝します。この研究は、キャメロン・R・カリーの取り組みを含め、ウィスコンシン大学マディソン校の研究・大学院教育担当副首相事務所の支援を受け、ウィスコンシン州同窓会研究財団からの資金提供を受けました。国立国立保健研究所翻訳研究のための卓越性(U19-AI109673-01)。リード・M・スタブベンディックは、国立医学図書館の生物学・医学研修プログラム(NLM 5T15LM007359)の計算と情報に対する研修助成金によって支援されました。資金提供者は、研究の設計、データ収集、解釈、または出版物のために作品を提出する決定に役割を持ちはありませんでした。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 μL disposable polystyrene inoculating loops, blue | VWR | 12000-806 | |
| 10 μL disposable polystyrene inoculating loops, yellow | VWR | 12000-810 | |
| 12-well cell culture plate, sterile with lid | Greiner bio-one | 665 180 | |
| 14 mL polystyrene round bottom tube, 17 x 100 mm 2style, nonpyrogenic, sterile | Falcon | 352057 | |
| 2.0 self standing screw cap tubes with caps, sterile | USA scientific | 1420-9710 | |
| 25 mL serological pipet | Cell Treat | 229225B | |
| Agar, bacteriological | VWR | J637 | |
| Brain Heart Infusion Broth | Dot Scientific | DSB11000-5000 | |
| Polycarbonate filament, white, 3 mm diameter | Keene Village Plastics | 12.1-3MM-WH-581.2-1KG-R | |
| School Glue | Elmer's | EPIE304 | |
| Taz 6 3D printer | Lulzbot |
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