اختبارات الثقافة المشتركة عاليه الانتاجيه للتحقيق في التفاعلات الميكروبية
Summary
اختبارات التفاعل الثقافة المشتركة المقدمة في هذا البروتوكول غير مكلفه ، والانتاجيه العالية ، وبسيطه. ويمكن استخدام هذه المقايسات لمراقبه التفاعلات الميكروبية في الثقافة المشتركة ، وتحديد أنماط التفاعل ، وتوصيف الإمكانات المثبطة لسلاله جرثوميه من الفائدة ضد مسببات الامراض البشرية والبيئية.
Abstract
وقد أدت دراسة التفاعلات بين الكائنات المجهرية إلى اكتشافات عديده ، من ميكروبات الرواية إلى رؤى في الإيكولوجيا الميكروبية. العديد من النهج المستخدمة لدراسة التفاعلات الميكروبية تتطلب معدات متخصصة ومكلفه والوقت المكثف. تقدم هذه الورقة بروتوكولا لاختبارات تفاعل الثقافة المشتركة التي تكون غير مكلفه وقابله للتطوير إلى أرقام العينات الكبيرة وقابله للتكيف بسهوله مع العديد من التصاميم التجريبية. يتم استزراع الكائنات المجهرية معا ، مع كل بئر يمثل مزيجا واحدا من الكائنات المجهرية. يتم استزراع كائن الاختبار علي جانب واحد من كل بئر واحتضانه لأول مره في الزراعة الاحاديه. وفي وقت لاحق ، يتم تطعيم الكائنات المستهدفة في الوقت نفسه علي الجانب الآخر من كل بئر باستخدام طابع التلقيح المطبوع ثلاثي الابعاد. بعد المشاركة في الثقافة ، يتم تسجيل الاختبارات المكتملة للظاهريات المرئية ، مثل النمو أو التثبيط. ويمكن استخدام هذه المقايسات لتاكيد الأنماط الظاهرية أو تحديد النقوش بين العزلات ذات الفائدة. باستخدام هذه الطريقة البسيطة والفعالة ، يمكن للمستخدمين تحليل مجموعات من الكائنات المجهرية بسرعة وكفاءه. هذا النهج الثقافة المشتركة ينطبق علي اكتشاف المضادات الحيوية وكذلك البحوث القائمة علي الثقافة الميكروبيوم وقد تم بالفعل تطبيقها بنجاح علي كلا التطبيقات.
Introduction
في الطبيعة ، نادرا ما توجد الكائنات المجهرية في عزله ؛ التالي ، فانها تتفاعل باستمرار مع الكائنات الأخرى. لذلك ، دراسة كيفيه تفاعل الكائنات المجهرية مع بعضها البعض أمر ضروري لفهم العديد من السلوكيات الميكروبية1. التفاعلات الميكروبية يمكن ان تكون متنافرة ، المعلق ، أو عدائيه. هذه في ذكر يمكن ان تؤثر ليس فقط علي الكائنات المجهرية أنفسهم ولكن أيضا البيئات والمضيفين ان الكائنات المجهرية استعمار1,2.
العديد من العلماء دراسة التفاعلات الميكروبية لتحديد جزيئات مضادات الميكروبات الجديدة. تم العثور علي واحده من أول جزيئات مضادات الميكروبات الهامه سريريا من خلال دراسة التفاعلات الميكروبية. لاحظ السير الكسندر فليمينغ تلوث Penicillium spp. عزل التي أعاقت نمو سلاله المكورات العنقودية ، مما ادي إلى اكتشاف المضادات الحيوية التي يشيع استخدامها البنسلين3. ويظل توصيف أليات التي تستخدمها الكائنات المجهرية لمعاداه منافسيها موردا مثمرا لاكتشاف الجزيئات المضادة للميكروبات. علي سبيل المثال, وقد تبين مؤخرا ان العقديات sp. سلاله Mg1 تنتج المضادات الحيوية linearmycins, التي لديها النشاط التحلل هذه ضد عصيه رقيقه4.
وعلاوة علي ذلك ، تم مؤخرا اكتشاف الببتيد غير ريبوسموكالي المسمي lugdunin بعد الملاحظة ان الأنف المعلق المكورات العنقودية lugdunin يمنع المكورات العنقوديةالذهبية 5. وقد أظهرت الدراسات أيضا ان التفاعلات الثنائية بين الكائنات المجهرية هي بنفس قوه التفاعلات العدائية لاكتشاف جزيئات مضاده للميكروبات. علي سبيل المثال ، العديد من النمل الزراعة الفطريات في قبيله Attini ميناء البكتيريا التكافلية دعا بسيودونوكارديا علي هيكلها التي تنتج جزيئات مضاده لمنع الممرض الملزمة من محصولهم الفطرية6. ونظرا لان دراسة التفاعلات الميكروبية كانت مفيده لاكتشاف جزيئات مضادات الميكروبات ، فان استخدام شاشات عاليه الانتاجيه قد يؤدي إلى اكتشاف جزيئات جديده مضاده للميكروبات.
وفيما يتعلق بتكلفه الأداء وسهولته ، فان المنهجيات المستخدمة لدراسة التفاعلات الميكروبية تتراوح بين البسيطة والمعقدة. علي سبيل المثال ، المقايسة أجار المكونات هي طريقه غير مكلفه وبسيطه التي يمكن استخدامها للتحقيق العداء بين الكائنات المجهرية متعددة7. ومع ذلك ، فحص المكونات أجار ليس اجراء فعالا ، ويمكن ان تكون كثيفه العمالة للعديد من مجموعات الاقران. لتقييم الآثار الناتجة عن المنتجات المجهرية علي العزلات المستهدفة من الفائدة بطريقه إنتاجيه عاليه ، والعديد من المختبرات استخدام اختبارات نشر القرص8. هذه المقايسات هي سهله وغير مكلفه ويمكن ان تكون قابله للتطوير إلى عدد أكبر من العينات7. ومع ذلك ، يتطلب هذا الفحص توليد المستخلصات الميكروبية وقد ينتج نتائج مضلله لمجموعات معينه من الكائنات الحية المستهدفة والمضادات الحيوية ، مثل السالمونيلا والسيفالوسبونات9.
تعتمد الطرق السابقة علي المكونات المعزولة للحصول علي استجابه في الكائن المستهدف ، بدلا من السماح للكائنات المجهرية بالتفاعل مع بعضها البعض. وهذا أمر جدير بالملاحظة لان التفاعلات بين الميكروبات قد تثير إنتاج جزيئات مضاده للميكروبات “مبهمه” لا تنتج في الزراعة الاحاديه. علي سبيل المثال, وقد تبين مؤخرا ان يتم إنتاج keyicin مضادات الميكروبات فقط بواسطة البوغانه sp. عندما شارك في الاستزراع مع sp. التي يتم عزلها من نفس ميكروبيوم الإسفنج10. وهناك منهجيات تفاعل أكثر تعقيدا تلتف حول هذا العائق الأحادي المحتمل. علي سبيل المثال ، فان iChip مفيد لعزل نادره وصعبه لزراعه البكتيريا من العينات البيئية ويسمح لمراقبه التفاعلات الميكروبية من خلال النمو في الموقع11. وللتحقيق في التفاعلات بالتفصيل ، يمكن استخدام مقياس الطيف الكتلي للتصوير بالليزر/التاين بمساعده المصفوفة في وقت التحليق. ويوفر هذا النهج معلومات مفصله عن تكوين وتوزيع الجزيئات الصغيرة والالببتيدات التي تنتجها المستعمرات الميكروبية المتفاعلة ذات الاستبانة المكانية العالية. وقد استخدمت أيضا في دراسات متعددة من التفاعلات البكتيرية لتوصيف أليات المنافسة12،13،14،15. ومع ذلك ، فان النظام المتكامل للرصد والرصد في كثير من الأحيان يتطلب اعدادا مضنيا من العينات ، وخبره متخصصة لتشغيل المعدات ، ومقاييس طيفيه عاليه التكلفة ومتخصصة. لهذه الأسباب ، هو تقنيه صعبه لاستخدامها للدراسات الانتاجيه العالية. وهكذا ، فان اختبار الثقافة المشتركة البسيط والقابل للتطوير والانتاجيه العالية للتفاعلات الميكروبية التي تتغلب علي العديد من القيود علي النهج المذكورة أعلاه سيكون مفيدا.
هنا ، يتم عرض بروتوكول لارتفاع الانتاجيه الميكروبية المشتركة الثقافة. هذا الفحص بسيط وسهل الدمج في الدراسات الموجودة مسبقا للتفاعلات الميكروبية. علي النقيض من العديد من الطرق الشائعة الاستخدام لدراسة التفاعلات الميكروبية ، طريقتنا بسيطه ، غير مكلفه ، وقابله للتحقيق في اعداد كبيره من التفاعلات. وهذه المقايسات ليست سهله التنفيذ فحسب ، ولكن المواد متاحه علي نطاق واسع من معظم موردي المختبرات أو الموارد العامة (مثل المكتبات والمساحات المكانية). التالي ، هذا الفحص هو مفيد كخط الأول من التحقيق لتحديد وتحليل أنماط مثيره للاهتمام بين العديد من مجموعات الاقران من الكائنات المجهرية ، والتي قد تكون مفيده بشكل خاص للتحقيق في الإيكولوجيا الميكروبية.
Protocol
Representative Results
Discussion
المضادات الحيوية والأيض الثانوية الأخرى التي توسط التفاعلات الميكروبية مفيده للعديد من التطبيقات, بما في ذلك اكتشاف المخدرات. هنا ، يتم تقديم بروتوكول لاختبارات الثقافة المشتركة لتقييم اعداد كبيره من التفاعلات الميكروبية. هذه الاختبارات تفاعل الثقافة المشتركة هي بسيطه, بأسعار معقولة, ق…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر دانيال ماي ، ومارك شيفريت ، ودون هوانج علي القراءة الناقدة للمخطوطة. وقد دعم هذا العمل ، بما في ذلك جهود كاميرون ر. كوري ، من قبل جامعه ويسكونسن ماديسون ، مكتب نائب المستشار للبحوث والدراسات العليا بتمويل من مؤسسه بحوث الخريجين ويسكونسن ، والتمويل المقدم أيضا من قبل المعاهد الوطنية للمراكز الصحية للتميز للبحوث الانتقالية (U19-AI109673). تم دعم ريد م. ستوبندييك من قبل المكتبة الوطنية للتدريب الطب منحه لحساب والمعلوماتية في البيولوجيا والطب برنامج التدريب (NLM 5T15LM007359). ولم يكن للممولين دور في تصميم الدراسة ، وجمع البيانات ، والترجمة الشفوية ، أو القرار بتقديم العمل للنشر.
Materials
| 1 μL disposable polystyrene inoculating loops, blue | VWR | 12000-806 | |
| 10 μL disposable polystyrene inoculating loops, yellow | VWR | 12000-810 | |
| 12-well cell culture plate, sterile with lid | Greiner bio-one | 665 180 | |
| 14 mL polystyrene round bottom tube, 17 x 100mm style, nonpyrogenic, sterile | Falcon | 352057 | |
| 2.0 self standing screw cap tubes with caps, sterile | USA scientific | 1420-9710 | |
| 25 mL serological pipet | Cell Treat | 229225B | |
| Agar, bacteriological | VWR | J637 | |
| Brain Heart Infusion Broth | Dot Scientific | DSB11000-5000 | |
| Polycarbonate filament, white, 3mm diameter | Keene Village Plastics | 12.1-3MM-WH-581.2-1KG-R | |
| School Glue | Elmer's | EPIE304 | |
| Taz 6 3D printer | Lulzbot |
References
- Stubbendieck, R. M., Vargas-Bautista, C., Straight, P. D. Bacterial Communities: Interactions to Scale. Frontiers in Microbiology. 7 (August), 1234 (2016).
- Green, J., Bohannan, B. J. M. Spatial scaling of microbial biodiversity. Trends in Ecology & Evolution. 21 (9), 501-507 (2006).
- Fleming, A. On the Antibacterial Action of Cultures of a Penicillium, with Special Reference to their Use in the Isolation of B. influenzæ. British Journal of Experimental Pathology. 10 (3), 226 (1929).
- Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. Escape from Lethal Bacterial Competition through Coupled Activation of Antibiotic Resistance and a Mobilized Subpopulation. PLoS Genetics. 11 (12), e1005722 (2015).
- Zipperer, A., et al. Human commensals producing a novel antibiotic impair pathogen colonization. Nature. 535 (7613), 511-516 (2016).
- Currie, C. R., Scott, J. A., Summerbell, R. C., Malloch, D. Fungus-growing ants use antibiotic-producing bacteria to control garden parasites. Nature. 398 (6729), 701-704 (1999).
- Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
- Heatley, N. G. A method for the assay of penicillin. The Biochemical Journal. 38 (1), 61-65 (1944).
- Clinical and Laboratory Standards Institute. . Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests; approved standard -11th ed. CLSI document M02-A11. , (2012).
- Adnani, N., et al. Coculture of Marine Invertebrate-Associated Bacteria and Interdisciplinary Technologies Enable Biosynthesis and Discovery of a New Antibiotic, Keyicin. ACS Chemical Biology. 12 (12), 3093-3102 (2017).
- Nichols, D., et al. Use of iChip for high throughput in situ cultivation of "uncultivable" microbial species. Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2445-2450 (2010).
- Gonzalez, D. J., et al. Microbial competition between Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus monitored by imaging mass spectrometry. Microbiology (Reading, England). 157 (Pt 9), 2485-2492 (2011).
- Hoefler, B. C., et al. Enzymatic resistance to the lipopeptide surfactin as identified through imaging mass spectrometry of bacterial competition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13082-13087 (2012).
- Hoefler, B. C., Straight, P. D. Imaging Mass Spectrometry, Metabolism, and New Views of the Microbial World. Natural Products Analysis. , 349-396 (2014).
- Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C. Translating metabolic exchange with imaging mass spectrometry. Nature Chemical Biology. 5 (12), 885-887 (2009).
- Stubbendieck, R. M., et al. Competition among Nasal Bacteria Suggests a Role for Siderophore-Mediated Interactions in Shaping the Human Nasal Microbiota. Applied and Environmental Microbiology. 85 (10), 1-17 (2019).
- Winkelmann, G. Microbial siderophore-mediated transport. Biochemical Society transactions. 30 (4), 691-696 (2002).
- Chevrette, M. G., et al. The antimicrobial potential of Streptomyces from insect microbiomes. Nature Communications. 10 (1), 516 (2019).
