该协议中提出的共区域互测定成本低廉、吞吐量高且简单。这些测定可用于观察共培养中的微生物相互作用,识别相互作用模式,并描述感兴趣的微生物菌株对人类和环境病原体的抑制潜力。
对微生物之间相互作用的研究已经导致许多发现,从新的抗菌素到微生物生态学的见解。许多用于研究微生物相互作用的方法都需要专门的设备,而且费用昂贵,而且时间密集。本文提出了一种共培养相互作用检测的协议,该检测成本低廉,可扩展到大样本数,并且易于适应大量实验设计。微生物被培养在一起,每个井代表一对微生物的组合。测试生物在每口井的一侧培养,并在单一培养中首次孵育。随后,目标生物体同时接种到每口井的对面,使用3D打印的接种印章。共同培养后,完成测定对视觉表型(如生长或抑制)进行评分。这些测定法可用于确认表型或识别感兴趣的分离物中的模式。利用这种简单而有效的方法,用户可以快速有效地分析微生物的组合。这种共培养方法适用于抗生素发现和基于培养的微生物群研究,并已成功地应用于这两种应用。
在自然界中,微生物很少孤立存在;因此,它们不断与其他生物相互作用。因此,研究微生物如何相互作用对于理解多种微生物行为至关重要。微生物相互作用可以是相互的、共的的或对立的。这些在三动性不仅影响微生物本身,而且影响微生物殖民1,2的环境和宿主。
许多科学家研究微生物相互作用,以识别新的抗菌分子。通过微生物相互作用的研究,发现了第一个临床上重要的抗菌分子。亚历山大·弗莱明爵士观察到一种污染性青霉素的分离物,它抑制了葡萄球菌菌株的生长,从而发现了常用的抗生素青霉素3。微生物用来对抗其竞争对手的机制的特性仍然是发现抗菌分子的富有成果的资源。例如,最近显示链球菌sp.菌株Mg1产生抗生素线霉素,对亚氏杆菌4具有溶性及降解活性。
此外,最近发现一种非核糖核酸合成的肽,名为lugdunin,经观察,鼻管金黄色葡萄球菌能抑制金黄色葡萄球菌5。研究还表明,微生物之间的相互作用与对抗性相互作用一样强大,对抗菌分子的发现也是如此。例如,许多真菌养殖蚂蚁在部落阿提尼窝着共生细菌称为伪诺卡迪亚在他们的外骨骼,产生抗真菌分子,以抑制其真菌作物的义务病原体6。由于微生物相互作用的研究有利于发现抗菌分子,使用高通量屏幕可能会导致发现新的抗菌分子。
在成本和性能方面,用于研究微生物相互作用的方法从简单到复杂不等。例如,琼脂塞测定是一种廉价而简单的方法,可用于研究多种微生物之间的对抗7。然而,琼脂塞测定不是一个有效的过程,对于许多成对组合来说,可能劳动密集型。为了以高通量的方式评估微生物生产的产品对目标分离物的影响,许多实验室使用磁盘扩散测定方法8。这些检测是容易和廉价的,可以扩展到更多的样本7。然而,这种测定需要生成微生物提取物,并可能产生误导性的结果,某些组合的目标生物和抗生素,如沙门氏菌和头孢菌素9。
上述方法依靠分离的成分在目标生物体中引起响应,而不是允许微生物相互相互作用。这是值得注意的,因为微生物之间的相互作用可能导致产生”神秘”的抗菌分子,这些分子不是在单一培养中产生的。例如,最近表明,抗菌键霉素只由微单体孢子产生,当与从同一海绵微生物群10分离的Rhodococcus sp.共同培养时。更复杂的交互方法规避了这种潜在的单一文化障碍。例如,iChip可用于从环境样本中分离稀有和难以培养的细菌,并允许通过原位11的生长来观察微生物相互作用。为了详细研究相互作用,可以使用矩阵辅助激光解吸/电光飞行成像质谱法(MALDI-TOF-IMS)。这种方法提供了关于小分子和肽的组成和分布的详细信息,这些小分子和肽是由与高空间分辨率相互作用的微生物菌落产生的。MALDI-TOF-IMS也被用于细菌相互作用的多种研究,以描述竞争机制12,13,14,15。然而,MALDI-TOF-IMS 通常需要费力的样品制备、操作设备的专业知识以及昂贵而专业的质谱仪。由于这些原因,它是一种难以用于高通量研究的技术。因此,针对微生物相互作用进行简单、可扩展和高通量的共同培养测定,克服了上述方法的许多局限性,将是有益的。
这里给出了高通量微生物共培养的协议。这种测定简单易入,并可轻松纳入微生物相互作用的预先存在的研究。与许多常用的微生物相互作用研究方法不同,我们的方法简单、价格低廉,适合研究大量的相互作用。这些检测不仅易于执行,而且材料可从大多数实验室供应商或公共资源(例如图书馆和制造商空间)广泛获得。因此,这种测定作为第一线调查,可以识别和分析许多微生物成对组合中的有趣模式,这对微生物生态学的调查可能特别有用。
抗生素和其他介导微生物相互作用的次级代谢物可用于多种应用,包括药物发现。本文提出了一种用于评估大量微生物相互作用的共同培养测定方案。这些共培养相互作用测定是一种简单、经济、可扩展和高通量的方法,可同时研究许多微生物的成对组合。目标生物在12孔板的井中,使用接种标记在测试生物体旁边被发现,并且根据对目标生物体的表型的目视检查对目标生物体的抑制进行评分。?…
The authors have nothing to disclose.
我们感谢丹尼尔·梅、马克·谢弗雷特和唐·黄对手稿的批判性阅读。这项工作,包括卡梅隆·柯里的努力,得到了威斯康星大学麦迪逊分校,研究和研究生教育副校长办公室的支持,由威斯康星校友研究基金会提供资金,资金也由国立卫生研究院转化研究卓越中心 (U19-AI109673-01)。Reed M. Stubbendieck 获得国家医学图书馆对生物和医学计算和信息学培训项目 (NLM 5T15LM007359) 的培训赠款的支持。资助者在研究设计、数据收集和解释方面没有作用,也没有提交作品以供出版的决定。
1 μL disposable polystyrene inoculating loops, blue | VWR | 12000-806 | |
10 μL disposable polystyrene inoculating loops, yellow | VWR | 12000-810 | |
12-well cell culture plate, sterile with lid | Greiner bio-one | 665 180 | |
14 mL polystyrene round bottom tube, 17 x 100mm style, nonpyrogenic, sterile | Falcon | 352057 | |
2.0 self standing screw cap tubes with caps, sterile | USA scientific | 1420-9710 | |
25 mL serological pipet | Cell Treat | 229225B | |
Agar, bacteriological | VWR | J637 | |
Brain Heart Infusion Broth | Dot Scientific | DSB11000-5000 | |
Polycarbonate filament, white, 3mm diameter | Keene Village Plastics | 12.1-3MM-WH-581.2-1KG-R | |
School Glue | Elmer's | EPIE304 | |
Taz 6 3D printer | Lulzbot |