成年小鼠中的科利耳表面制备
Summary
本文介绍了一种改良的耳蜗表面制备方法，该方法需要去钙化和使用细胞和组织粘合剂，将耳蜗上皮片粘附到10毫米圆盖滑片上，用于成年小鼠耳蜗的免疫组织化学。
Abstract
耳蜗的听觉处理取决于美发毛细胞的完整性。在一生中，听力损失可以从多种病因中获得，例如暴露于过度噪音、使用耳毒性药物、细菌或病毒性耳部感染、头部受伤和老化过程。感觉毛细胞的丧失是获得性听力损失的一个常见的病理特征。此外，内发细胞突触可能由轻度侮辱损坏。因此，耳蜗上皮的表面制剂，结合免疫标记技术和共聚焦图像，是研究耳蜗病理学，包括带状突触和感觉毛细胞损失的非常有用的工具，头发细胞和支持细胞中蛋白质水平的变化，毛细胞再生，以及报告基因表达（即GFP）的测定，用于验证转导细胞类型的成功转导和鉴定。耳蜗，内耳的骨螺旋形结构，持有听觉感觉端器官，Corti（OC）的器官。OC 中的感官毛细胞和周围的支撑细胞包含在耳蜗管中，并停留在罗勒膜上，以非同位素方式组织，在基底进行高频检测，在顶点进行低频检测。随着分子和遗传信息的提供，以及通过敲除和敲击技术操纵基因的能力，小鼠在生物学研究，包括听力科学中得到了广泛的应用。然而，成年小鼠耳蜗是微小的，和耳蜗上皮被封装在骨迷宫，使微解剖困难。虽然解剖技术已经在许多实验室开发和使用，这种使用细胞和组织粘合剂的经过修改的微解剖方法更容易和更方便。它可用于所有类型的成年小鼠耳蜗后去钙化。
Introduction
耳蜗致力于声音的检测，并负责听力。耳蜗管盘绕在骨迷宫的螺旋形状，并持有听觉感觉端器官，Corti （OC） 的器官。OC位于巴西拉膜上，组成耳蜗上皮，在成年CBA/CaJ小鼠1，2中解开时，其长度约为5.7毫米。由于 OC 具有在基部检测到的高频和顶点的低频，因此耳蜗上皮通常分为三个部分进行分析比较：对应于低的尖心、中间和基底转，中检和高频检测。除了一系列支持细胞外，OC 由一排内毛细胞 （IHC） 组成，这些细胞位于地中海，三行外毛细胞 （OHC）相对于耳蜗螺旋横向位于。
正确的听觉处理取决于耳蜗中感觉毛细胞的完整性。感觉毛细胞受损或丧失是获得性听力损失的常见病理特征，由多种病因引起，如暴露于过度噪音、使用耳毒性药物、细菌或病毒性耳部感染、头部损伤和老化过程3.此外，内发细胞/听觉神经突触的完整性和功能可能受到轻度侮辱4的损伤。随着分子和遗传信息的提供，以及通过敲除和敲击技术对基因的操纵，小鼠在听力科学中得到了广泛的应用。虽然成年小鼠耳蜗是微小的，耳蜗上皮被骨质胶囊包围，导致技术难度的微分泌，但上皮的表面制剂与免疫标记或免疫组化学结合使用和共聚焦图像已广泛用于研究耳蜗病理学，包括带状突触和毛细胞的损失，感觉毛细胞和支持细胞中蛋白质水平的变化，以及毛细胞再生。科利耳表面制剂也用于确定报告基因（即GFP）的表达模式，确认成功的转导和识别转导细胞类型。这些技术以前曾用于研究分子机制基础噪声诱发听力损失使用成人CBA/J小鼠5，6，7，8，9。
与使用石蜡节或冷冻节进行免疫组织化学，以获得含有三个外毛细胞 （OHC） 和一个内发细胞 （IHC） 的耳蜗小横截面部分，耳蜗表面制剂允许用于计算感觉毛细胞和带状突触的OC的整个长度的可视化，以及与特定功能频率对应的感官毛细胞的免疫标记。表1显示了听力频率的映射，根据穆勒1和维伯格和Canlon1，2的研究，在成年CBA/J小鼠的耳蜗螺旋长度上，作为距离的函数。耳蜗表面制剂已广泛用于研究耳蜗病4，5，6，7，8，9，10 ，11，12，13，14，15。全山耳蜗解剖法最初在1966年由汉斯·恩斯特罗姆编辑的一本书中描述。这项技术后来被改进，并适应各种物种，如文献中描述的一些科学家在听力科学10，11，12，13， 15，17和由伊顿皮博迪实验室在马萨诸塞州的眼睛和耳朵18。最近，蒙哥马利等人又报道了另一种耳蜗解剖方法。耳蜗的微解剖是耳蜗表面制剂的一个基本和关键步骤。然而，解剖小鼠耳蜗是一个技术挑战，需要大量练习。这里，提出了一种改良的耳蜗表面制备方法，用于成年小鼠耳蜗。该方法要求去化和使用细胞和组织粘合剂（即细胞-塔克）将耳蜗上皮片粘附到10毫米圆形盖玻片上，用于免疫标记。细胞和组织胶粘剂已广泛应用于免疫组织化学20。这种改良的耳蜗微解剖方法与之前报道的18、19相比相对简单。
Protocol
Representative Results
Discussion
全座表面制剂的耳蜗微分泌与免疫标签相结合，为研究内耳病理和分子机制提供了基本工具。这种改性成人小鼠耳蜗解剖方法使用细胞和组织粘合剂简化了这一困难的过程。
虽然这种经过修改的耳蜗表面制备方法相对容易和容易获得，但它仍然需要练习才能达到熟练程度。为了进行正确的削减，分部门需要仔细集中。由于路耳蜗感觉毛细胞在基底转弯是如此接近螺旋边缘，?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
所述研究项目得到了国家卫生研究院耳聋和其他通信障碍研究所R01 DC009222的资助。这项工作在MUSC的WR大楼内进行，在授予C06 RR014516支持的翻新空间内进行。动物被安置在MUSC CRI动物设施中，得到国家研究资源中心校外研究设施计划提供的C06 RR015455的资助。作者感谢约琴·沙赫特博士的宝贵评论和安德拉·特拉斯卡对手稿的校对。
Materials
| 10-mm Rund Coverslips | Microscopy products for science and industry | 260367 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher Scientific | A-21125 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A11012 | |
| Carboard Micro Slide Trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Cell-Tak | BD Biosciences | 354240 | |
| Corning Petri Dishes | Fisher Scientific | 353004 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| Dumont #5 Forceps | FST fine science tools | 11251-20 | |
| EDTA Disodium Salt | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluoro-gel with Tris Buffer | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
| Four-well Cell Culture Dishes | Greiner Bio-One | 627170 | |
| Goat Anti-myosin VIIa Antibody | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse Anti-CtBP2 Antibody | BD Biosciences | #612044 | |
| Mouse Anti-Glu2R Antibody | Millipore | MAB397 | |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Scalpel | VWR | 100491-038 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 |
References
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