הכנה לפני שבלול בעכבר למבוגרים
Summary
מאמר זה מציג משטח שונה הכנה שבלול שיטה הדורשת decalcification ושימוש של תא ודבק רקמה לדבוק פיסות של epithelia לכסות 10 מ”מ כיסוי עגול עבור אימונוהיסטוכימיה העכבר למבוגרים כנימת.
Abstract
עיבוד השמיעה בתוך שבלול תלוי בשלמות של תאי השיער המכניים. במשך החיים, אובדן שמיעה ניתן לרכוש הרבה חבלות כגון חשיפה לרעש מוגזם, השימוש בתרופות האוטוטוקסינים, זיהומים חיידקיים או נגיפי האוזן, פציעות ראש, ואת תהליך ההזדקנות. אובדן תאים שיער חושי היא תכונה פתולוגית נפוצה של זנים של אובדן שמיעה נרכש. בנוסף, תא השיער הפנימי סינפסה יכול להיפגע על ידי עלבונות קלים. לכן, ההכנות פני השטח של epithelia שבלול, בשילוב עם טכניקות אימונויניום ודימויים קונפוקלית וקד, הם כלי שימושי מאוד לחקירת הפתווגיות שבלול, כולל הפסדים של הסינפסות של רצועת הכלים ותאי שיער חושי, שינויים ברמות החלבונים בתאי השיער והתאים התומכים, התחדשות תאי השיער וקביעת הביטוי הגנטי של הדוח (כלומר, GFP) לאימות התמרה מוצלחת וזיהוי של סוגי תאים שעברו התמרה. שבלול, מבנה בצורת ספירלה גרמי באוזן הפנימית, מחזיק את האיבר החושי קצה השמיעה, האיבר של Corti (OC). תאים שיער חושי התאים התומכים המקיפים ב-OC הם כלולים צינור שבלול ולנוח על קרום בזיאר, מאורגן באופנה tonotopic נושא עם זיהוי תדר גבוה המתרחשים בבסיס ובתדר נמוך בקודקוד. עם הזמינות של מידע מולקולרי וגנטי ואת היכולת לתמרן גנים על ידי הסתרה וטכניקות דפיקה, עכברים כבר בשימוש נרחב במחקר ביולוגי, כולל במדעי השמיעה. עם זאת, העכבר המבוגר שבלול הוא זעיר, ואת האפיתל שבלול הוא כימוס במבוך הגרמי, הפיכת מיקרו לנתיחה קשה. למרות טכניקות הניתוח פותחו ונעשה שימוש במעבדות רבות, זו שיטה מיקרודיסקציה שונה באמצעות דבק תא ורקמות קל יותר ונוח יותר. ניתן להשתמש בו בכל סוגי שבלול העכבר המבוגר בעקבות decalcification.
Introduction
שבלול מוקדש זיהוי של קול ואחראי לשמיעה. תעלת השבלול מתפתל בצורת ספירלה במבוך הגרמי ומחזיקה את האיבר החושי הסופי של השמיעה, העוגב של קורטי (OC). OC נח על קרום בזיאר, הפיכת האפיתל שבלול, עם אורך של כ 5.7 מ”מ כאשר הסרת מתפתל ב cba/caj עכברים מבוגרים1,2. בגלל OC הוא tonotopically מריחה על הרקמות עם תדרים גבוהים זוהה בבסיס תדרים נמוכים בפיסגה, אפיתל שבלול מחולק לעתים קרובות לשלושה חלקים עבור השוואות אנליטיות: apical, האמצעי, ו בסיס הופך מתאים נמוך, בינוני, וזיהוי תדר גבוה, בהתאמה. בנוסף למערך של תאים תומכים, ה-OC מורכב משורה אחת של תאי שיער פנימיים (IHCs) הממוקמת באופן מדעי ושלוש שורות של תאי שיער חיצוניים (OHCs) ממוקמים באופן משני ביחס לספירלה השבלול.
עיבוד שמיעתי נכון תלוי בשלמות תאי השיער החושי בתוך שבלול. נזק או אובדן של תאי שיער חושי היא תכונה פתולוגית נפוצה של אובדן שמיעה נרכש, שנגרמו על ידי הרבה חבלות כגון חשיפה לרעש מוגזם, שימוש בתרופות אוטוטוקסיות, דלקות אוזניים חיידקי או נגיפי, פציעות ראש, והזדקנות תהליך3. בנוסף, את היושרה והתפקוד של תא השיער הפנימי/מעצבי העצב השמיעה יכול להיות לקוי על ידי העלבונות קל4. עם הזמינות של מידע מולקולרי וגנטי ומניפולציה של גנים על ידי הסתרה וטכניקות דפיקה, עכברים כבר בשימוש נרחב במדע שמיעה. למרות שבלול העכבר המבוגר הוא זעיר ואת האפיתל שבלול הוא מוקף כמוסה גרמי וכתוצאה מכך מיקרוניתוח קשה מבחינה טכנית, משטח ההכנות של האפיתל בשילוב עם אימונויניום או אימונוהיסטוכימיה והדמיה קונפוקלית וקד שימשו באופן נרחב לחקירת הפתווגיות שבלול, כולל הפסדים של הסינפסות של הסרט ותאי השיער, שינויים ברמות של חלבונים בתאי שיער חושי ותאים תומכים, והתחדשות תא השיער. ההכנות פני השטח שבלול שימשו גם כדי לקבוע את תבנית הביטוי של גנים הכתב (כלומר, GFP) ולאשר התמרה מוצלחת ולזהות סוגי תאים התמרה. טכניקות אלה שימשו בעבר למחקר של מנגנונים מולקולריים בבסיס אובדן שמיעה המושרה רעש באמצעות מבוגרים cba/J עכברים5,6,7,8,9.
בניגוד אימונוהיסטוכימיה באמצעות מקטעים פרפין או קריוקטדורים כדי לקבל חלקים החוצה חתך קטן של שבלול המכילים שלושה תאים השיער החיצוני (OHCs) ואחד תא השיער הפנימי (IHC) על כל קטע, משטח שבלול ההכנות לאפשר ויזואליזציה של האורך כולו של OC לספירת תאים שיער חושי וסינפסות סרט ואימונויניום של תאי שיער חושי המתאימים תדרים פונקציונליים ספציפיים. טבלה 1 מראה את המיפוי של תדרי שמיעה כפונקציה של מרחק לאורך הספירלה שבלול ב-cba/J עכבר למבוגרים על פי לימודים מולר1 ו Viberg ו canlon1,2. ההכנות פני השטח שבלול כבר בשימוש נרחב לחקירת הפתווגיות שבלול4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13.14,15 שיטת הניתוח השבלול המלא תוארה במקור בספר שנערך על ידי הנס אנגלסטרום ב-196616. טכניקה זו הייתה מעודנת ומותאמת למגוון של מינים כמתואר בספרות על ידי מספר מדענים במדעי השמיעה10,11,12,13, 15,17 ועל ידי מעבדות איטון-פיבודי ב מסצ עין ואוזן18. לאחרונה דווח על שיטה נוספת לחיתוך שבלול על-ידי מונטגומרי ואח ‘19. מיקרודיסקציה של שבלול הוא צעד חיוני וקריטי עבור ההכנות פני השטח של שבלול. עם זאת, מבתר כנימת העכבר הוא אתגר טכני ודורש פרקטיקה ניכרת. כאן, שיטת הכנה לפני השבלול שונה מוצגת לשימוש כנימת העכבר למבוגרים. שיטה זו דורשת decalcification ושימוש בדבק תא ורקמות (כלומר, Cell-Tak) כדי לדבוק פיסות של אפיתל שבלול כדי 10 מ”מ שמיכות עגול מחליק עבור immunolabeling. דבק תא ורקמה שימש באופן נרחב עבור אימונוהיסטוכימיה20. שיטה זו שונה לנתיחה המיקרודיסקציה היא פשוטה יחסית לאלה שדווחו בעבר18,19.
Protocol
Representative Results
Discussion
ניתוח שבלול של פני השטח הכולל בשילוב עם האימונואולבלינג מספק כלי בסיסי לחקירת הפתווגיות באוזן הפנימית ומנגנונים מולקולריים. זה שונה העכבר המבוגר לנתיחה שבלול שיטה באמצעות התא ואת הדבק מפשט את ההליך הזה קשה.
למרות שיטת ההכנה לפני שבלול זו שונה יחסית קלה ונגישה, היא עדיין דו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרויקט המחקר תיאר היה נתמך על ידי גרנט R01 DC009222 מן המכון הלאומי על חירשות והפרעות תקשורת אחרות, המכון הלאומי לבריאות. עבודה זו נערכה בבניין WR ב MUSC בחלל משופץ נתמך על ידי גרנט C06 RR014516. בעלי חיים היו שוכנו במתקני בעלי חיים MUSC, הנתמכת על ידי מענק C06 RR015455 מתוכנית מחקר של אקסטרקיר של המרכז הלאומי למשאבי מחקר. המחברים מודים לד ר ג’צ’ן שכטר על הערותיו היקרות ועל הגהה של כתב היד.
Materials
| 10-mm Rund Coverslips | Microscopy products for science and industry | 260367 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher Scientific | A-21125 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A11012 | |
| Carboard Micro Slide Trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Cell-Tak | BD Biosciences | 354240 | |
| Corning Petri Dishes | Fisher Scientific | 353004 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| Dumont #5 Forceps | FST fine science tools | 11251-20 | |
| EDTA Disodium Salt | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluoro-gel with Tris Buffer | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
| Four-well Cell Culture Dishes | Greiner Bio-One | 627170 | |
| Goat Anti-myosin VIIa Antibody | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse Anti-CtBP2 Antibody | BD Biosciences | #612044 | |
| Mouse Anti-Glu2R Antibody | Millipore | MAB397 | |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Scalpel | VWR | 100491-038 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 |
References
- Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse. Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).
- Viberg, A., Canlon, B. The guide to plotting a cochleogram. Hearing Research. 197 (1-10), (2004).
- Sha, S. H., Schacht, J. Emerging therapeutic interventions against noise-induced hearing loss. Expert Opinion on Investigational Drugs. 26 (1), 85-96 (2017).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after “temporary” noise-induced hearing loss. Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Chen, F. Q., Zheng, H. W., Hill, K., Sha, S. H. Traumatic Noise Activates Rho-Family GTPases through Transient Cellular Energy Depletion. Journal of Neuroscience. 32 (36), 12421-12430 (2012).
- Hill, K., Yuan, H., Wang, X., Sha, S. H. Noise-Induced Loss of Hair Cells and Cochlear Synaptopathy Are Mediated by the Activation of AMPK. Journal of Neuroscience. 36 (28), 7497-7510 (2016).
- Xiong, H. Inhibition of Histone Methyltransferase G9a Attenuates Noise-Induced Cochlear Synaptopathy and Hearing Loss. Journal of Association for Research in Otolaryngology. 20 (3), 217-232 (2019).
- Yuan, H., et al. Autophagy attenuates noise-induced hearing loss by reducing oxidative stress. Antioxidant & Redox Signaling. 22 (15), 1308-1324 (2015).
- Wang, X. Mitochondrial Calcium Transporters Mediate Sensitivity to Noise-Induced Losses of Hair Cells and Cochlear Synapses. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 469 (2018).
- Bohne, B. A., Harding, G. W. Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology. Hearing Research. 109 (1-2), 34-45 (1997).
- Jiang, H., Sha, S. H., Forge, A., Schacht, J. Caspase-independent pathways of hair cell death induced by kanamycin in vivo. Cell Death & Differentiation. 13 (1), 20-30 (2006).
- Johnsson, L. G., Hawkins, J. E. Sensory and neural degeneration with aging, as seen in microdissections of the human inner ear. Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology. 81 (2), 179-193 (1972).
- Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma. Elife. 3, (2014).
- Wang, L. Targeting HDAC with a novel inhibitor effectively reverses paclitaxel resistance in non-small cell lung cancer via multiple mechanisms. Cell Death & Disease. 7, 2063 (2016).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).
- Engström, H., Ades, H. W., Andersson, A. . Structural pattern of the organ of Corti: a systematic mapping of sensory cells and neural elements. , (1966).
- Hawkins, J. E., Linthicum, F. H., Johnsson, L. G. Cochlear and vestibular lesions in capsular otosclerosis as seen in microdissection. Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology Supplement. 87, 1-40 (1978).
- . MassEyeAndEar.org Available from: https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories (2019)
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).
- . Corning Cell Culture Surfaces Available from: https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf (2019)
- Nouvian, R., Beutner, D., Parsons, T. D., Moser, T. Structure and function of the hair cell ribbon synapse. The Journal of Membrane Biology. 209 (2-3), 153-165 (2006).
- Atturo, F., Barbara, M., Rask-Andersen, H. On the anatomy of the ‘hook’ region of the human cochlea and how it relates to cochlear implantation. Audiology and Neurootology. 19 (6), 378-385 (2014).
- Kim, N., Steele, C. R., Puria, S. The importance of the hook region of the cochlea for bone-conduction hearing. Biophysical Journal. 107 (1), 233-241 (2014).
- Zheng, H. W., Chen, J., Sha, S. H. Receptor-interacting protein kinases modulate noise-induced sensory hair cell death. Cell Death & Disease. 5, 1262 (2014).
- Brown, L. N., et al. Macrophage-Mediated Glial Cell Elimination in the Postnatal Mouse Cochlea. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 407 (2017).
